嘧啶并5,4,D嘧啶化合物、包含其的组合物及其用途

相关申请的交叉引用

根据适用的法律，本申请要求于2021年4月19日提交的美国临时申请No.63/201,222的优先权，其内容出于所有目的通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明总体上涉及嘧啶并[5,4-d]嘧啶化合物、包含其的药物组合物以及它们在治疗和预防以RAS-ERK途径的失调为特征的疾病(例如癌症、RAS通路病)中的用途。

背景技术

RAS-RAF-MEK-ERK(RAS：大鼠肉瘤；RAF：快速加速纤维肉瘤；MEK：丝裂原激活的蛋白激酶；ERK：细胞外信号调控激酶)信号传导途径(以下简称为RAS-ERK途径)在将生长因子受体产生的增殖信号从质膜传递到细胞核中发挥着关键作用。在大部分癌症中，该途径通过受体酪氨酸激酶(RTK)(例如ERBB1、ERBB2、FLT3、RET、KIT)的激活、RAS调控子(SOS1和NF1)的激活或失活、以及RAS基因(H-、K-和NRAS；癌症中的总共30％)或BRAF基因(癌症的8％)中的组成型激活突变而失调。KRAS突变在胰腺癌(>90％)、结直肠癌(50％)和肺癌(30％)中的发病率尤其高。就其本身而言，BRAF突变在恶性黑素瘤(70％)、甲状腺癌(40％)和结直肠癌(10％)中的出现频率特别高(突变频率基于COSMIC(癌症体细胞突变目录(Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer)；Wellcome Trust Sanger Institute)发布v95，2021年11月24日)。

RAS蛋白是小的GTP酶，其将细胞外生长信号传递至细胞内效应子以控制如细胞分化、增殖和存活的重要过程(Nat.Rev.Cancer 2003,3,459)。RTK刺激后，质膜上发生RAS的生理激活，导致GTP酶的GTP负载，从而导致其激活。激活的RAS相互作用并激活一系列效应分子，其中RAF激酶是癌症发展中最关键的RAS相互作用因子(Nature Rev.DrugDiscov.2014,13,828)。RAS同种型中的甘氨酸12、甘氨酸13或谷氨酰胺61的致癌突变导致人癌症中的异常和组成性信号传导(Nat.Rev.Cancer 2003,3,459)(COSMIC发布v95，2021年11月24日)。

在RAS下游，哺乳动物细胞表达三种RAF旁系同源物(ARAF、BRAF和CRAF)，它们共享保守的C端激酶结构域(KD)(Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2015,16,281)和包含RAS结合结构域(RBD)的N端调控区(NTR)。在未刺激的细胞中，RAF蛋白作为单体被螯合在细胞质中。GTP结合的激活RAS与RBD的结合诱导RAF激酶的膜锚定(Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2015,16,281)。与此同时，RAF蛋白经历激酶结构域侧对侧二聚化和催化激活(Nature 2009,461,542)。激活的RAF蛋白通过从RAF到MEK、然后从MEK到ERK的磷酸化级联传递信号，导致一系列底物被ERK磷酸化，从而引发细胞特异性响应(Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2020年10月；21(10),607)。

迄今为止，RAF同种型的激活突变主要局限于BRAF基因，尽管在ARAF和CRAF中观察到了罕见的变体，这强调了该同种型的功能重要性(COSMIC发布v95，2021年11月24日)。BRAF中最常见的癌症突变是位置600处缬氨酸取代为谷氨酸(称为BRAF

为了解决现有的医疗需求，过去十年中开发了一系列广泛的ATP竞争性RAF抑制剂(Nat.Rev.Cancer 2017,17,676)。努力主要集中在最常见的非RAS依赖性BRAF突变(BRAF

同时，表现出RAS活性的肿瘤-由于RAS突变激活或RTK信号传导升高，但在其他方面为BRAF野生型-显示出对BRAF

最近采取了两种策略来规避第一代RAF抑制剂在RAS突变的癌症中的局限性。第一种策略依赖于这样的观察：矛盾的ERK激活是一种剂量依赖性现象，即诱导发生在亚饱和抑制剂浓度下，但当化合物占据RAF二聚体的两个原聚体时，该途径在饱和浓度下受到抑制。因此，该第一种策略侧重于开发对所有RAF旁系同源物具有更高结合亲和力的分子，以便在较低药物浓度下使RAF蛋白饱和，从而减少矛盾途径诱导(Bioorg.Med.Chem.Lett.2012,22,6237；Cancer Res.2013,73,7043；J.Med.Chem.2015,58,4165；Cancer Cell 2017,31,466；J Med Chem.2020,63,2013；Clin Cancer Res.2021,27,2061；Nature 2021,594,418)。然而，这些化合物保留了很强的RAF二聚体诱导能力，因此矛盾地刺激了RAS-ERK信号传导，尽管其幅度低于前几代RAF抑制剂。尽管此类化合物显示出改进的特性，但最近显示它们大多不影响ARAF同种型，这导致矛盾途径激活和原发性抗性，以及在体外和临床环境中出现获得性抗性(Clin Cancer Res.2021,27,2061；Nature 2021,594,418)。第二种策略包括设计化合物，其使BRAF激酶结构域在非活性状态下构象偏向并因此不会矛盾地诱导ERK信号传导。这催生了“悖论破坏者”(Paradox Breaker，PB)分子PLX8394，它是PLX4032/维莫非尼的衍生物(Nature2015,526,583)。这些分子保留了针对BRAF

仍然需要有效且一致地阻断携带多种RAS和RAF基因型的人肿瘤细胞中RAS-ERK信号传导和细胞增殖的抑制剂。重要的是，开发此类抑制剂在多种RAS突变肿瘤细胞系中也没有矛盾途径诱导是非常令人期望的。

发明内容

根据一方面，本发明涉及式I的化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂合物：

其中：

R

R

R

X

X

X

Y选自H、卤素、CN、OH、OC

条件是所述化合物不是：

式I的化合物还根据任何实施方式以及本说明书通篇描述的实施例来定义。

根据另一方面，本发明涉及用于前述实施方式中任一个所定义的用途的药物组合物，该组合物包含如本文所定义的化合物连同药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一方面，本发明涉及如本文定义的化合物用于治疗选自以下的疾病或病症的用途：增殖性疾病或病症、由RAS-ERK信号级联失调引起的发育异常(RAS通路病)、或炎性疾病或免疫系统病症。

本发明还进一步涉及用于治疗选自以下的疾病或病症的方法：增殖性疾病或病症、由RAS-ERK信号级联失调引起的发育异常(RAS通路病)、或炎性疾病或免疫系统病症，包括向有需要的受试者施用如本文定义的化合物。还考虑了用于抑制细胞异常增殖的方法，包括使细胞与如本文所定义的化合物接触。

在上述用途和方法的一个实施方式中，疾病或病症选自肿瘤和发育异常，例如与RAF基因突变(例如ARAF、BRAF或CRAF)相关的疾病或病症、与RAS基因突变(例如KRAS)相关的疾病或病症、或与RAF基因突变和RAS基因突变两者相关的疾病或病症。在一个实施方式中，疾病或病症与受体酪氨酸激酶突变或扩增(例如EGFR、HER2)或受体下游的RAS的调控子的突变(例如SOS1功能获得、NF1功能丧失)相关。

例如，疾病或病症是肿瘤，例如选自黑素瘤、甲状腺癌(例如乳头状甲状腺癌)、结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肝癌、肉瘤、胃癌、胰腺癌、巴雷特氏腺癌(Barret'sadenocarcinoma)、神经胶质瘤(例如室管膜瘤)、肺癌(例如非小细胞肺癌)、头颈癌、急性淋巴母细胞性白血病、急性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤和毛细胞白血病的那些。例如，肿瘤选自结肠癌或结直肠癌、肺癌、胰腺癌、甲状腺癌、乳腺癌和黑素瘤。例如，本发明的用途和方法中的任一者包括抑制RAS-ERK信号传导途径，而不显著诱导矛盾途径。

在阅读以下示例性实施方式和实施例部分的非限制性描述后，本发明的化合物、组合物、方法和用途的另外的目的和特征将变得更加明显，其不应被解释为限制本发明的范围。

附图说明

图1示出了在RAS突变的HCT116细胞中不诱导pERK信号传导的矛盾诱导(Y

图2示出了用不诱导pERK或pMEK信号传导的矛盾诱导的代表性化合物(实施例80；上图)和作为比较的在相同细胞系中诱导该途径的化合物(PLX4720；下图)处理的RAS突变的HCT-116细胞的免疫印迹分析结果。

具体实施方式

本文使用的所有技术和科学术语和表述具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的定义相同的定义。然而，下面提供了所使用的一些术语和表达的定义。如果通过引用并入本文的出版物、专利和专利申请中的术语定义与本说明书中阐述的定义相反，则以本说明书中的定义为准。本文使用的章节标题仅用于组织目的，并不应被解释为限制所公开的主题。

i.

本文描述的化学结构是根据常规标准绘制的。另外，当所绘制的原子(例如碳原子)似乎包括不完整的化合价时，则假定该化合价由一个或多个氢原子满足，即使这些不一定明确地绘制。氢原子应该被推断为化合物的一部分。

本文所用的术语仅用于描述特定实施例的目的并且不旨在进行限制。应当注意，单数形式“一”、“一个”和“该”也包括复数形式，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及含有“一种化合物”的组合物也涵盖两种或多种化合物的混合物。还应注意，术语“或”通常以其包括“和/或”的含义使用，除非上下文另外明确指出。此外，就详细描述和/或权利要求中使用的术语“包括”、“包含”、“具有”、“具有”、“有”或其变体而言，此类术语旨在以类似于术语“包括/包含”的方式包含。

术语“约”或“大约”意指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受的误差范围内，这将部分取决于该值是如何测量或确定的，即，该测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在1个或大于1个标准偏差内。替选地，“约”可以意指给定值的至多20％、优选至多10％、更优选至多5％并且还更优选至多1％的范围。替选地，特别是对于生物系统或过程，该术语可以表示在一个值的一个数量级内，优选在5倍内，并且更优选在2倍内。当在本申请和权利要求中描述特定值时，除非另有说明，否则应当假定术语“约”意指在特定值的可接受的误差范围内。

如本文所用，术语“化合物”、“本文所述的化合物”、“本申请的化合物”、“嘧啶并[5,4-d]嘧啶化合物”、“嘧啶并嘧啶化合物”和等同表述是指本申请中描述的化合物，例如结构式I所涵盖的那些，任选地参考任何适用的实施方式，并且还包括示例性化合物，例如实施例1至实施例114的化合物以及它们的药学上可接受的盐、溶剂合物、酯和前药(适用时)。当可能是两性离子形式时，为了实际目的，该化合物可以被绘制为其中性形式，但该化合物被理解为还包括其两性离子形式。本文的实施方式还可以排除一种或多种化合物。化合物可以通过其化学结构或其化学名称来识别。如果化学结构和化学名称发生冲突，则以化学结构为准。

除非另有说明，否则本文描绘的结构还意在包括结构的所有异构体(例如，对映异构体、非对映异构体和几何(或构象))形式(当适用时)；例如，每个不对称中心的R和S构型。因此，本发明化合物的单一立体化学异构体以及对映异构体、非对映异构体和几何(或构象)混合物在本说明书的范围内。除非另有说明，否则治疗性化合物还涵盖所示化合物的所有可能的互变异构形式(如果有的话)。该术语还包括同位素标记的化合物，其中一个或多个原子的原子质量不同于自然界中最丰富的原子质量。可掺入本发明化合物中的同位素的实例包括但不限于

当优选特定对映异构体时，在一些实施方式中，其可以基本上不含相应的对映异构体并且还可以是对映异构体富集的。“对映异构体富集”意指该化合物由明显更大比例的一种映异构体组成。在某些实施方式中，该化合物由至少约90重量％的优选对映异构体制成。在其他实施方式中，化合物由至少约95重量％、98重量％或99重量％的优选对映异构体组成。优选的对映异构体可以通过本领域技术人员已知的任何方法从外消旋混合物中分离，包括手性载体上的高压液相色谱(HPLC)以及手性盐的形成和结晶，或者通过不对称合成来制备。

表述“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的那些盐，其在合理的医学判断范围内适合用于与人和低等动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏响应等，并与合理的收益/风险比相称。药学上可接受的盐是本领域众所周知的。例如，S.M.Berge,等人于J.Pharmaceutical Sciences,66:1-19(1977)中详细描述了药学上可接受的盐。所述盐可以在本发明的化合物的最终分离和纯化过程中原位制备，或者通过使化合物的游离碱官能团与合适的有机或无机酸(酸加成盐)反应或通过使化合物的酸官能团与合适的有机或无机碱(碱加成盐)反应来单独制备。

术语“溶剂合物”是指本发明化合物中的一者与一种或多种溶剂分子(包括水和非水溶剂分子)的物理缔合。这种物理缔合可以包括氢键合。在某些情况下，例如当一种或多种溶剂分子掺入结晶固体的晶格中时，溶剂合物将能够分离。术语“溶剂合物”既涵盖溶液相溶剂合物，也涵盖可分离溶剂合物。示例性溶剂合物包括但不限于水合物、半水合物、乙醇化物、半乙醇化物、正丙醇化物、异丙醇化物、1-丁醇化物、2-丁醇化物和其他生理学上可接受的溶剂的溶剂合物，例如International Conference on Harmonization(ICH),Guidefor Industry,Q3CImpurities:Residual Solvents(1997)中描述的3类溶剂。因此，本文所述的化合物还包括其溶剂合物及其混合物中的每一种。

如本文所用，表述“药学上可接受的酯”是指通过本说明书的方法形成的化合物的酯，其可以在体内水解，并且包括在人体内容易分解以留下母化合物或其盐的那些酯。合适的酯基包括例如源自药学上可接受的脂族羧酸，特别是链烷酸、链烯酸、环链烷酸和链烷二酸的那些，其中每个烷基或链烯基部分有利地具有不超过6个碳原子。具体酯的实例包括但不限于羟基基团的甲酸酯、乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯、丙烯酸酯和乙基琥珀酸酯，以及酸性基团的烷基酯。其他酯基包括磺酸酯或硫酸酯。

如本文所用的表述“药学上可接受的前药”是指通过本发明的方法形成的化合物的那些前药，其在合理的医学判断的范围内适合用于与人和低等动物的组织接触并有过度的毒性、刺激、过敏响应等，与合理的收益/风险比相称，并且对其预期用途有效。如本文所用的“前药”意指可在体内通过代谢方式(例如通过水解)转化以提供由本说明书的式所描述的任何化合物的化合物。

也可以在整个申请中使用缩写，除非另有说明，否则这样的缩写旨在具有本领域通常理解的含义。此类缩写的实例包括Me(甲基)、Et(乙基)、Pr(丙基)、i-Pr(异丙基)、Bu(丁基)、t-Bu(叔丁基)、i-Bu(异丁基)、s-Bu(仲丁基)、c-Bu(环丁基)、Ph(苯基)、Bn(苄基)、Bz(苯甲酰基)、CBz或Cbz或Z(苄氧羰基)、Boc或BOC(叔丁氧基羰基)，和Su或Suc(琥珀酰亚胺)。为了更加确定，具体缩写的附加定义也包含在实施例部分的介绍中。

烃基取代基中的碳原子数可以由前缀“C

如本文所用的术语“烷基”是指通常含有1至20个碳原子的饱和、直链或支链烃基基团。例如，“C

如本文所用的术语“烯基”表示含有一个或多个双键且通常含有2至20个碳原子的直链或支链烃基。例如，“C

如本文所用的术语“炔基”表示含有一个或多个三键且通常含有2至20个碳原子的直链或支链烃基。例如，“C

术语“环烷基”、“脂环族”、“碳环”、“碳环状”和等同表述是指在单环或多环环体系中包含饱和或部分不饱和(非芳族)碳环的基团，包括螺环(共享一个原子)、稠合(共享至少一个键)或桥接(共享两个或更多个键)碳环体系，具有三至十五个环成员。环烷基基团的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯-1-基、环戊烯-2-基、环戊烯-3-基、环己基、环己烯-1-基、环己烯-2-基、环己烯-3-基、环庚基、双环[4,3,0]壬基、降冰片基等。术语环烷基包括未取代的环烷基基团和取代的环烷基基团两者。例如，术语“C

如本文所用，术语“杂环”、“杂环烷基”、“杂环基”、“杂环基团”和“杂环状环”可互换使用，并且是指化学稳定的3-至7-元单环或7-10-元双环杂环部分，其是饱和的或部分不饱和的并且除碳原子外还具有一个或多个、优选1至4个如上所定义的杂原子。当用于指杂环的环原子时，术语“氮”包括取代的氮。作为实例，在具有1至3个选自氧、硫或氮的杂原子的饱和或部分不饱和环中，氮可以是N(如在3,4-二氢-2H-吡咯基中)、NH(如在吡咯烷基中)或NR)如在N-取代的吡咯烷基中)。杂环状环可以在产生化学稳定结构的任何杂原子或碳原子处附接至其悬垂(侧链)基团，并且任何环原子可以被任选取代。杂环烷基基团的实例包括但不限于1,3-二噁茂烷、吡咯烷基、吡咯烷酮基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、四氢二噻吩基、四氢噻吩基、硫代吗啉代、噻噁烷基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁基、高哌啶基、氧杂环庚烷基、噻环庚烷基、氧氮杂

如本文所用，术语“部分不饱和”是指在环原子之间包含至少一个双键或三键但不是芳族的环部分。术语“部分不饱和”旨在涵盖具有多个不饱和位点的环，但不旨在包括如本文所定义的芳基或杂芳基部分。

单独使用或作为较大部分(例如“芳烷基”、“芳烷氧基”、“芳基氧基”或“芳基氧基烷基”)中的一部分使用的术语“芳基”是指具有4n+2个共轭π(pi)电子的芳族基团，其中n是1至3的整数，处于具有总共6至15个环成员的单环部分或双环或三环稠环体系中，其中该体系中的至少一个环是芳族的并且其中该体系中的每个环含有三至七个环成员。术语“芳基”可以与术语“芳基环”互换使用。在本说明书的某些实施方式中，“芳基”是指芳香环体系，其包括但不限于苯基、联苯基、萘基、薁基、蒽基等，其可以带有一个或多个取代基。术语“芳烷基”或“芳基烷基”是指附接至芳环的烷基残基。芳烷基的实例包括但不限于苄基、苯乙基等。如其在本文中所用，术语“芳基”的范围内还包括其中芳族环稠合至一个或多个非芳族环的基团，例如茚满基、茚基、邻苯二甲酰亚胺基、萘酰亚胺基、芴基、菲啶基或四氢萘基等。例如，术语“C

单独使用或作为较大部分(例如“杂芳烷基”或“杂芳烷氧基”)的一部分使用的术语“杂芳基”是指具有4n+2个共轭π(pi)电子的芳族基团，其中n是1至3整数(例如具有5至18个环原子，优选5、6或9个环原子；具有在环状阵列中共享的6、10或14个π电子)；并且除碳原子外还具有1至5个杂原子。术语“杂原子”包括但不限于氮、氧或硫，并且包括氮或硫的任何氧化形式，以及碱性氮的任何季铵化形式。杂芳基可以是单环或两个或多个稠环。如本文所用的术语“杂芳基”还包括其中杂芳族环稠合至一个或多个芳基、脂环族或杂环状环的基团，其中附接基团或点位于杂芳族环上。杂芳基基团的非限制性实例包括噻吩基、呋喃基(呋喃基)、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、吲哚基、3H-吲哚基、异吲哚基、吲嗪基、苯并噻吩基(苯并噻吩基)、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并三唑基、吡咯并吡啶基(例如吡咯并[3,2-b]吡啶基或吡咯并[3,2-c]吡啶基)、吡唑并吡啶基(例如吡唑并[1,5-a]吡啶基)、呋喃并吡啶基、嘌呤基、咪唑并吡嗪基(例如咪唑并[4,5-b]吡嗪基)、喹啉基(喹啉基)、异喹啉基(异喹啉基)、喹诺酮基、异喹诺酮基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、4H-喹嗪基、萘啶基和蝶啶基、咔唑基、吖啶基、菲啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基和吡啶并[2,3-b]-l,4-噁嗪-3(4H)-酮。杂芳基基团可以是单环或双环的。杂芳基基团包括被任选取代的环。术语“杂芳烷基”是指被杂芳基取代的烷基基团，其中烷基和杂芳基部分独立地被任选取代。实例包括但不限于吡啶基甲基、嘧啶基乙基等。例如，术语“C

如本文所述，本发明的化合物可含有“任选取代的”部分。一般而言，术语“取代的”，无论其前面是否有术语“任选”，意指指定部分的一个或多个氢被合适的取代基替代。除非另有说明，否则“任选取代的”基团可以在该基团的每个可取代位置具有合适的取代基，并且当任何给定结构中的多于一个位置可以被多于一个选自特定基团的取代基取代时，该取代基在每个位置处可以相同或不同。本说明书中设想的取代基的组合优选是导致形成化学稳定或化学可行的化合物的那些。如本文所用的术语“化学稳定的”是指当受到允许其产生、检测以及在某些实施方式中其回收、纯化和用于一种或多种本文公开的目的的条件时基本上不改变的化合物。

术语“卤素”表示卤素原子，即氟、氯、溴或碘原子，优选氟或氯。

术语“任选取代的”是指通过被取代基独立替代在其上的一个、两个或三个或多个氢原子而经取代或未取代的基团，所述取代基包括但不限F、Cl、Br、I、OH、CO

ii.

本文中变量的任何定义中的化学基团列表的列举包括该变量作为任何单个基团或所列基团的组合的定义。本文变量的实施方式的叙述包括该实施方式作为任何单个实施方式或与任何其他实施方式或其部分的组合。本文的实施方式的叙述包括该实施方式作为任何单个实施方式或与任何其他实施方式或其部分的组合。因此，如果适用，以下实施方式可以单独存在或组合存在。

本发明的化合物呈现嘧啶并[5,4-d]嘧啶核结构，其上附接有限定的取代基以实现产物的有益活性。如本文所定义的嘧啶并嘧啶化合物的实例由通式I示出：

其中：

R

R

R

X

X

X

Y选自H、卤素、CN、OH、OC

或其药学上可接受的盐或溶剂合物；

条件是所述化合物不是：

例如，吸电子基团选自全卤代烷基(例如CF

根据一个实施例，Y是H并且所有其他基团是如本文定义的。根据另一个实施例，Y是NH

例如，式I中的氨基芳基磺酰胺部分指定为L并且选自：

其中，虚线(---)代表键。

在又一个实施方式中，R

其中：

R

R

R

R

R

或者，R

(---)表示键；

其中当R

其中当R

在一个实施方式中，R

在另一个实施方式中，R

在另一个实施方式中，R

在另一个实施方式中，R

在另一个实例中，R

其中：

X

R

(---)表示键。

替选地，R

其中：

X

R

R

(---)表示键。

在优选的实施方式中，R

在另一个实施方式中，R

其中：

X

R

其中X

其中X

在另一个实例中，R

其中：

R

n是选自0至8的整数；或

n是2至8，并且两个R

(---)表示键。

在一个实施方式中，R

在另一个实例中，R

在另一个实施方式中，式I的化合物是式II的化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂合物：

其中R

在又一个实施方式中，式I的化合物是式III的化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂合物：

/>

其中R

示例性R

/>

/>

其中(---)表示键。

在一个实施方式中，R

在式I的化合物的一个实施方式中，R

在另一个实施方式中，R

在另一个实施方式中，R

R

其中(---)表示键，并且其中所述基团任选被进一步取代。

例如，R

其中(---)表示键。

在一个实施方式中，R

其中：

R

R

R

其中包括在R

在另一个实施方式中，R

其中：

R

X

X

X

其中R

其中包括在R

其中(---)表示键。

在另一个实施方式中，R

其中：

X

其中X

在一个实施方式中，式I的化合物是式IV或式V的化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂合物：

其中R

在另一个实施方式中，式I的化合物是式VI或式VII的化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂合物：

/>

其中R

在上式的一个实施方式中，X

在另一个实施方式中，X

在另一个实施方式中，R

在另一个实施方式中，X

在又一个实施方式中，R

在另一个实施方式中，R

在另一个实施例中，R

其中R

在又一个实施例中，R

其中R

实施例部分中还提供了另外的子通用实施方式，其中每个取代基基团R

更具体地，示例性R

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

其中(---)代表键。

在一个实施方式中，R

以下实施方式描绘了R

C1-L-B1；C1-L-B2；C1-L-B3；C1-L-B4至B70；C1-L-B71；C1-L-B72；C1-L-B73；C1-L-B74；C1-L-B75至B77；

C2-L-B1；C2-L-B2；C2-L-B3；C2-L-B4至B70；C2-L-B71；C2-L-B72；C2-L-B73；C2-L-B74；C2-L-B75至B77；

C3-L-B1；C3-L-B2；C3-L-B3；C3-L-B4至B70；C3-L-B71；C3-L-B72；C3-L-B73；C3-L-B74；C3-L-B75至B77；

C4至C488-L-B1；C4至C488-L-B2；C4至C488-L-B3；C4至C488-L-B4至B70；C4至C488-L-B71；C4至C488-L-B72；C4至C488-L-B73；C4至C488-L-B74；C4至C488-L-B75至B77；

C489-L-B1；C489-L-B2；C489-L-B3；C489-L-B4至B70；C489-L-B71；C489-L-B72；C489-L-B73；C489-L-B74；C489-L-B75至B77；

C490-L-B1；C490-L-B2；C490-L-B3；C490-L-B4至B70；C490-L-B71；C490-L-B72；C490-L-B73；C490-L-B74；C490-L-B75至B77；

C491至C493-L-B1；C491至C493-L-B2；C491至C493-L-B3；C491至C493-L-B4至B70；C491至C493-L-B71；C491至C493-L-B72；C491至C493-L-B73；C491至C493-L-B74；或C491至C493-L-B75至B77。

在一个实施方式中，所述化合物如式I中所定义，其中：

-R

-R

-L是选自L1至L4的基团，Y是H或NH

在另一个实施方式中，所述化合物如式I中所定义，其中R

如本文所定义的示例性化合物包括表2、表3、表4和表5中在实施例1至实施例163下涵盖的每种单个化合物。

优选化合物的实施例是，即表3、表4和表5的实施例31、36、40、51、55至60、69、72、80至83、88、93、94、96至122、124至147、149、151至160、162和163。更优选的化合物的实施例包括表3和表5的实施例80至83、93、94、96、98至101、104、106、111、112、114至116、119、120、122、125、128至134、139、142、144至146、153、155、157、159和162。

应理解，任何上述化合物可以是任何无定形、结晶或多晶型形式，包括任何盐或溶剂合物形式，或其混合物。本说明书的化合物可以通过经由本文描述的任何合成手段附加各种官能团来进一步修饰，以增强选择性生物特性。此类修饰是本领域已知的，并且包括增加对给定生物系统(例如，血液、淋巴系统、中枢神经系统)的生物渗透、增加口服利用度、增加溶解度以允许通过注射施用、改变代谢和改变排泄速率的那些。

这些化合物可以通过常规化学合成来制备，例如本发明的方案和实施例中示例的那些。如本领域技术人员可以理解的，合成本文化学式的化合物的其他方法对于本领域普通技术人员来说是明显的。另外，各种合成步骤可以以交替的顺序或次序进行以得到所想要的化合物。

iii.

如本文所用，术语“有效量”意指将引起例如研究人员或临床医生正在寻求的对组织、系统、动物或人类的生物或医学响应的药物或药剂的量。此外，术语“治疗有效量”意指与未接受此类量的相应受试者相比，导致疾病、病症或其症状的治疗、治愈、预防或改善，或疾病或病症的进展速度减少的任何量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量。

如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”和“治疗(treating)”是指逆转、减轻如本文所述的疾病或病症或其一种或多种症状、延迟其发作或抑制其进展。在一些实施方式中，在已经出现一种或多种增殖之后，可以施用治疗。在其他实施方式中，在不存在症状的情况下施用治疗。例如，可以在症状出现之前对易感个体施用治疗(例如，根据症状病史和/或根据遗传或其他易感因素)。症状消退后也可以继续治疗，例如预防或延迟其复发。

在一个实施方式中，待治疗的疾病或疾患是增殖性疾病或病症，或激酶介导的疾病或病症。更具体地，待治疗的疾病或病症包括增殖性疾病或病症、由RAS-ERK信号级联失调引起的发育异常(RAS通路病)、炎性疾病或免疫系统病症。

根据一些实例，待治疗的增殖性疾病或病症是肿瘤、炎性疾病或疾患、或发育异常，涉及RAS和/或RAF基因中的组成型激活突变(例如KRAS和/或ARAF、BRAF或CRAF突变)。疾病或病症还可与受体酪氨酸激酶突变或扩增(例如EGFR、HER2)或受体下游的RAS的调控子的突变(例如SOS1功能获得、NF1功能丧失)进一步相关。例如，如本文定义的化合物是信号酶(例如B-和CRAF)的抑制剂，其不仅在携带RAF突变(例如BRAF

根据一个实施方式，疾病或病症的特征在于不受控制的细胞增殖，即“增殖性病症”或“增殖性疾病”。更具体地，这些疾病和病症涉及具有自主生长能力的细胞，即，以快速增殖的细胞生长为特征的疾患的异常状态，其通常形成明显的团块，表现出部分或完全缺乏结构组织和与正常组织的功能协调。

例如，增殖性病症或疾病被定义为“肿瘤(neoplasm)”、“肿瘤性病症”、“瘤变”、“癌症”和“肿瘤(tumor)”，这些术语共同旨在涵盖造血系统肿瘤(例如淋巴瘤或白血病)以及实体瘤(例如肉瘤或癌)，包括所有类型的癌前和癌性生长或致癌过程、转移组织或恶性转化的细胞、组织或器官，无论组织病理学类型或侵袭阶段如何。造血系统肿瘤是影响造血结构(与血细胞形成有关的结构)和免疫系统组分的恶性肿瘤，包括源自骨髓谱系、淋巴谱系或红系谱系的白血病(与白细胞(白血细胞)及其在血液和骨髓中的前体有关)，以及淋巴瘤(与淋巴细胞相关)。实体瘤包括肉瘤，肉瘤是起源于结缔组织例如肌肉、软骨、血管、纤维组织、脂肪或骨的恶性肿瘤。实体瘤还包括癌，即由上皮结构产生的恶性肿瘤，包括外部上皮(例如，皮肤和胃肠道、肺和子宫颈的内膜)和内衬各种腺体(例如，乳腺、胰腺、甲状腺)的内部上皮。肿瘤的实例包括白血病和肝细胞癌、肉瘤、血管内皮癌、乳腺癌、中枢神经系统癌(例如星形细胞瘤、胶质肉瘤、成神经细胞瘤、少突神经胶质瘤和胶质母细胞瘤)、前列腺癌、肺癌和支气管癌、喉癌、食道癌、结肠癌、结直肠癌、胃肠癌、黑素瘤、卵巢癌和子宫内膜癌、肾癌和膀胱癌、肝癌、内分泌癌(例如甲状腺)和胰腺癌。例如，所述疾病或病症选自结肠癌、肺癌、胰腺癌、甲状腺癌、乳腺癌和皮肤癌。肿瘤的实例包括黑素瘤、甲状腺乳头状癌、结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肝癌、肉瘤、胃癌、巴雷特氏腺癌、神经胶质瘤(包括室管膜瘤)、肺癌(包括非小细胞肺癌)、头颈癌、急性淋巴母细胞白血病、急性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤和毛细胞白血病。

在实施方式中，呈现上述造血系统或实体瘤中的一者的患者先前已接受RAS-ERK途径靶向抑制剂(包括RTK、RAF、MEK或ERK抑制剂)的治疗，但已对所述抑制剂产生抗性。抑制剂包括标准护理治疗，例如维莫非尼、达拉非尼、考比替尼、曲美替尼、YERVOY、OPDIVO或这些药剂的任何组合。

在实施方式中，待治疗的疾病被定义为由RAS-ERK信号级联失调引起的发育异常(RAS通路病：例如，努南综合征(Noonan syndrome)、科斯特洛综合征(Costellosyndrome)、LEOPARD综合征、心面皮肤综合征和肥厚性心肌病)。

在实施方式中，待治疗的疾病被定义为炎性疾病或免疫系统病症。此类炎性疾病或免疫系统病症的实例包括炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、多发性硬化症、甲状腺炎、1型糖尿病、结节病、牛皮癣、过敏性鼻炎、哮喘、COPD(慢性阻塞性肺疾病)。

在一个实施方式中，如本文定义的化合物是携带至少一种突变的RAS或RAF基因型的肿瘤细胞中RAS-ERK信号传导和细胞增殖的抑制剂，不诱导或基本上不诱导矛盾途径。

如本文所用的术语“患者或受试者”是指动物，例如哺乳动物。因此，受试者可以指例如小鼠、大鼠、狗、猫、马、牛、猪、豚鼠、包括人的灵长类动物等。优选地，受试者是人。

因此，本说明书还涉及治疗患有增殖性疾病或病症(例如，RAF-突变和/或突变的RAS驱动的癌症)的受试者(例如人受试者)的方法。该方法包括向需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的如本文定义的化合物。

在某些实施方式中，本说明书提供了治疗受试者的病症(如本文所述)的方法，其包括向被鉴定为需要其的受试者施用本说明书的化合物。需要治疗上述病症的那些患者的鉴定完全在本领域技术人员的能力和知识范围内。医学领域认识到用于鉴定处于发展可通过主题方法治疗的上述病症的风险的患者的某些方法，例如受试者患者的家族史以及存在与发展该疾病状态相关的风险因子。本领域医疗人员可以通过使用例如临床测试、体检、病史/家族史和遗传测定来容易地识别这样的候选患者。

评估受试者治疗功效的方法包括通过本领域熟知的方法确定病症的治疗前症状，然后向受试者施用治疗有效量的本发明的化合物。在施用化合物后的适当时间段(例如，1周、2周、1个月、6个月)后，再次确定病症的症状。病症的症状和/或生物标志物(例如pERK或pMEK)的调节(例如减少)表明治疗的功效。可以在整个治疗过程中定期确定病症的症状和/或生物标志物。例如，可以每隔几天、几周或几个月检查病症的症状和/或生物标志物以评估治疗的进一步功效。疾病的症状和/或生物标志物的减少表明治疗是有效的。

在一些实施方式中，治疗有效量的如本文定义的化合物可以单独或以与药学上可接受的载体、佐剂或媒介物混合的组合物形式施用给患者。

表述“药学上可接受的载体、佐剂或媒介物”和等同表述是指不破坏与其配制的化合物的药理学活性的无毒载体、佐剂或媒介物。可用于本发明的组合物中的药学上可接受的载体、佐剂或赋形剂包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如人血清白蛋白)、缓冲物质(例如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质，例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。

本文描述的组合物可以经口、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、经直肠、经鼻、经颊或经由植入贮库施用。如本文使用的术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。其他施用方式还包括皮内或透皮施用。

用于经口施用的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除了活性化合物之外，液体剂型还可含有本领域常用的惰性稀释剂，例如例如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇脂肪酸酯及其混合物。除了惰性稀释剂之外，经口组合物还可以包含佐剂，例如润湿剂、乳化剂和助悬剂、表面活性剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。

可根据已知技术使用合适的分散剂或润湿剂和助悬剂配制可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性混悬剂。无菌注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液、混悬液或乳液，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的媒介物和溶剂包括水、林格氏溶液(Ringer's solution)、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发性油通常用作溶剂或助悬介质。为此目的，可以使用任何温和的非挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸也用于制备注射剂。

可注射制剂可以被灭菌，例如，通过穿过细菌截留过滤器过滤，或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂，所述无菌固体组合物可在使用前溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射介质中。

为了延长所提供的化合物的作用，通常想要减缓皮下或肌内注射的化合物的吸收。这可以通过使用水溶性差的结晶或无定形材料的液体混悬液来实现。化合物的吸收速率则取决于其溶解速率，而溶解速率又可取决于晶体尺寸和晶体形式。替选地，通过将化合物溶解或悬浮在油媒介物中来实现肠胃外施用的化合物形式的延迟吸收。可注射的贮库形式是通过在可生物降解的聚合物(例如聚丙交酯-聚乙交酯)中形成化合物的微囊基质来制备的。根据化合物与聚合物的比率以及所用特定聚合物的性质，可以控制化合物释放的速率。

其他生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。储库注射制剂也可以通过将化合物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。

用于直肠施用的组合物优选为栓剂，其可以通过将本说明书的化合物与合适的非刺激性赋形剂或载体例如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合来制备，所述赋形剂或载体在环境温度下为固体但在体温下为液体并因此在直肠中融化并释放活性化合物。

用于经口施用的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在此类固体剂型中，将活性化合物与至少一种惰性的药学上可接受的赋形剂或载体混合，例如柠檬酸钠或磷酸二钙，和/或a)填充剂或增量剂例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和/或硅酸，b)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖和阿拉伯胶，c)保湿剂，例如甘油，d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠，e)溶液阻滞剂，例如石蜡，f)吸收促进剂，例如季铵化合物，g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯，h)吸收剂例如高岭土和膨润土，和i)润滑剂例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠及其混合物。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包含缓冲剂。

类似类型的固体组合物也可用作软填充明胶胶囊和硬填充明胶胶囊中的填充剂，使用赋形剂例如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等。片剂、糖衣丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的固体剂型可以用包衣和壳来制备，例如肠溶包衣和药物配制领域熟知的其他包衣。它们可以任选地含有遮光剂，并且还可以具有这样的组成：它们仅或优选地在肠道的特定部分中任选地以延迟的方式释放一种或多种活性成分。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。类似类型的固体组合物也可用作软填充明胶胶囊和硬填充明胶胶囊中的填充剂，使用赋形剂例如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等。

该组合物还可以是具有如上所述的一种或多种赋形剂的微囊形式。片剂、糖衣丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的固体剂型可以用包衣和壳来制备，例如肠溶包衣、控释包衣和药物配制领域熟知的其他包衣。在此类固体剂型中，活性化合物可以与至少一种惰性稀释剂例如蔗糖、乳糖或淀粉混合。按照正常实践，此类剂型还可以包含除惰性稀释剂之外的其他物质，例如压片润滑剂和其他压片助剂，例如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包含缓冲剂。它们可以任选地含有遮光剂，并且还可以具有这样的组成：它们仅或优选地在肠道的特定部分中任选地以延迟的方式释放一种或多种活性成分。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。

用于局部或经皮施用本说明书的化合物的剂型包括软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、粉剂、溶液剂、喷雾剂、吸入剂或贴剂。在无菌条件下将活性组分与药学上可接受的载体以及可能需要的任何所需的防腐剂或缓冲剂混合。眼用制剂、滴耳剂和滴眼剂也涵盖在本说明书的范围内。另外，该说明书考虑了透皮贴剂的使用，其具有提供化合物向身体的受控递送的附加优点。此类剂型可以通过将化合物溶解或分散在适当的介质中来制备。吸收促进剂也可以用于增加化合物穿过皮肤的通量。可以通过提供速率控制膜或通过将化合物分散在聚合物基质或凝胶中来控制速率。

本文提供的药学上可接受的组合物还可以通过鼻气雾剂或吸入施用。此类组合物根据药物制剂领域熟知的技术制备，并且可以使用苯甲醇或其他合适的防腐剂、增强生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其他常规增溶剂或分散剂制备为盐水溶液。

本文提供的药学上可接受的组合物可被配制以经口施用。此类制品可在有或没有食物的情况下施用。在一些实施方式中，本发明的药学上可接受的组合物在没有食物的情况下施用。在其他的实施方式中，本发明的药学上可接受的组合物在有食物的情况下施用。

可以与载体材料组合以产生呈单一剂型的组合物的化合物的量将根据待治疗的患者和具体的施用模式而变化。所提供的组合物可以配制为使得可以向接受这些组合物的患者施用0.01mg/kg体重/天至100mg/kg体重/天之间的抑制剂剂量。

还应理解，对于任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、排泄速率、药物组合、治疗医生的判断，以及与增殖性疾病或病症相关的症状的严重程度。组合物中提供的化合物的量也将取决于组合物中的具体化合物。

本文描述的化合物或组合物可以使用有效治疗如本文所考虑的症状或减轻本文所考虑的症状的严重性的任何量和任何施用途径来施用。所需的确切量因受试者而异，这取决于受试者的物种、年龄和一般状况、感染的严重程度、具体药剂、其施用模式等。所提供的化合物优选配制为单位剂型，以便于施用和剂量的均匀性。如本文所用的表述“单位剂型”是指适合于待治疗的患者的物理上离散的药剂单位。然而，应理解，本发明的化合物和组合物的每日总用量将由主治医师在合理的医学判断的范围内决定。

本发明的药学上可接受的组合物可以经口、经直肠、肠胃外、脑池内、腹膜内、局部(如通过粉剂、软膏剂或滴剂)、经颊、作为口腔或鼻喷雾剂等施用给人和其他动物，这取决于正在治疗的感染的严重程度。在某些实施方式中，所提供的化合物可以以每天约0.01mg/kg至约50mg/kg、优选约1mg/kg至约25mg/kg的受试者体重的剂量水平经口或肠道外施用，一天一次或多次，以获得所想要的治疗效果。

应理解，本发明的化合物和组合物的每日总用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。以单次或分次剂量施用给受试者的本发明的化合物的每日总抑制剂量可以是例如0.01mg/kg体重至50mg/kg体重、或更通常0.1mg/kg体重至25mg/kg体重的量。单剂量组合物可以含有这样的量或其约数以构成每日剂量。在一个实施方式中，根据本发明的治疗方案包括每天以单剂量或多剂量向需要此类治疗的患者施用约10mg至约1000mg的本发明的一种或多种化合物。

根据待治疗的疾病或病症，另外的治疗剂也可以存在于本发明的组合物中或作为剂量方案的一部分单独施用，例如额外的化疗剂。可与本发明化合物组合使用的另外的治疗剂的非限制性实例包括抗增殖化合物，例如芳香酶抑制剂；抗雌激素；抗雄激素；戈那瑞林激动剂；拓扑异构酶I抑制剂；拓扑异构酶II抑制剂；微管活性剂；烷化剂；类视黄醇、类胡萝卜素、生育酚；环氧合酶抑制剂；MMP抑制剂；抗代谢药；铂化合物；甲硫氨酸氨肽酶抑制剂；双膦酸盐；抗增殖抗体；乙酰肝素酶抑制剂；Ras致癌同种型的抑制剂；端粒酶抑制剂；蛋白酶体抑制剂；用于治疗血液恶性肿瘤的化合物；驱动蛋白纺锤体蛋白抑制剂；Hsp90抑制剂；mTOR抑制剂；PI3K抑制剂；Flt-3抑制剂；CDK4/6抑制剂；HER2抑制剂(赫赛汀、曲妥珠单抗)；EGFR抑制剂(易瑞沙、特罗凯、贺俪安、泰瑞霸、爱必妥)；RAS抑制剂；MEK抑制剂(曲美替尼、贝美替尼、考比替尼)；ERK抑制剂(优立替尼)；抗PD-1抗体(Opdivo,Keytruda)；抗-CTLA4抗体(Yervoy)；抗肿瘤抗生素；亚硝基脲类；靶向/降低蛋白质或脂质激酶活性的化合物、靶向/降低蛋白质或脂质磷酸酶活性的化合物、或任何其他抗血管生成化合物。

该治疗还可以辅以其他治疗或干预措施，例如手术、放射治疗(例如，伽马辐射、中子束放疗、电子束放疗、质子疗法、近距离放射治疗和全身放射性同位素)、生物响应调节剂(例如，干扰素、白介素、肿瘤坏死因子(TNF)、以及用于减轻不良作用的药物。

本文变量的实施方式的叙述包括该实施方式作为任何单个实施方式或与任何其他实施方式或其部分的组合。本文的实施方式的叙述包括该实施方式作为任何单个实施方式或与任何其他实施方式或其部分的组合。

实施例

缩写列表：

Ac：乙酰基

AcOEt：乙酸乙酯

AcOH：乙酸

Ar：芳基

ATCC：美国菌种保藏中心

ATP：三磷酸腺苷

BINOL：[1,1'-联二萘]-2,2'-二醇

Boc：叔丁氧基羰基

BOP：(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐

br：宽

BSA：牛血清白蛋白

CCL：癌细胞系

DCE：1,2-二氯乙烷

DCM：二氯甲烷

DIEA(或DIPEA)：N,N-二异丙基乙胺(Huenig碱)

DME：1,2-二甲氧基乙烷

DMF：N,N-二甲基甲酰胺

DMSO：二甲基亚砜

DTT：二硫苏糖醇

EA：乙酸乙酯

EC

ECL：增强化学发光

EDTA：乙二胺四乙酸

Et

EtOH：乙醇

Eu：铕

FBS：胎牛血清

GST：谷胱甘肽S-转移酶

HATU：O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’,-四甲基脲鎓六氟磷酸盐

HEPES：4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸

Het：杂环

Hex：己烷

HRMS：高分辨率质谱

HPLC：高效液相色谱

HRP：辣根过氧化物酶

IC

IPA或iPrOH：异丙醇

LCMS：液相色谱质谱

MeCN：乙腈

MS：质谱

NMP：N-甲基吡咯烷酮

NMR：核磁共振

ON：过夜

PBS：磷酸盐缓冲盐水

pERK：磷酸化的胞外信号调控激酶

PMB：对甲氧基苄基

PMSF：苯基甲基磺酰氟

Rf：滞留因子

RPMI-1640：罗斯威尔公园纪念研究所培养基

RT：室温

SDS：十二烷基硫酸钠

SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

SEM：三甲基甲硅烷基乙氧基甲基

SNAr：亲核芳族取代

TBST：含0.2％ Tween-20的Tris缓冲盐水

TBTU：O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓四氟硼酸盐

TEV：烟草蚀刻病毒蛋白酶

TFA：三氟乙酸

THF：四氢呋喃

TLC：硅胶薄层色谱

TR-FRET：时间分辨荧光共振能量转移

Ts：对甲苯磺酸盐

Y

以下非限制性实施例是说明性实施方式并且不应被解释为进一步限制本发明的范围。参考附图将更好地理解这些实施例。

下文提出的实施例提供了某些示例性化合物获得的合成和实验结果。如本领域技术人员众所周知的，必要时反应在惰性气氛(氮气或氩气)中进行，以保护反应组分免受空气和湿气的影响。温度以摄氏度(℃)给出。除非另有说明，否则溶液百分比和比率表示体积与体积的关系。下面实施例中使用的反应物可以如本文所述获得，或者如果本文没有描述，其本身可以可商购获得或者可以通过本领域已知的方法由可商购获得的材料制备。使用Teledyne Isco Rf Combiflash仪器在二氧化硅(SiO

使用Agilent仪器进行制备型HPLC，其使用Phenomenex-Kinetex C18(21x100mm,5μm)柱，流速为20mL/min(RT)并在220nm和254nm处进行UV检测。除非另有说明，否则流动相由溶剂A(5％ MeOH、95％水+0.1％甲酸)和溶剂B(95％ MeOH、5％水+0.1％甲酸)组成。正如文中所指出的，两种溶剂中偶尔使用0.05％ TFA或0.1％ AcOH或其他添加剂代替0.1％甲酸作为添加剂。在两个流动相中还使用MeCN代替MeOH，以实现文本中指定的更具挑战性的分离。实施例中提供了具体的梯度条件，但以下是代表性的：T(0)→T(3min)等度，根据化合物极性，使用10％至50％溶剂B，随后12分钟梯度至100％溶剂B。最后5分钟使用100％溶剂B。

LCMS分析在Agilent仪器上进行。在Phenomenex Kinetex C18柱(2.6μm；

除非另有说明，否则说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、反应条件、浓度、性质、稳定性等的所有数字应理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。至少，每个数值参数至少应该根据报告的有效数字的数量并通过应用普通的四舍五入技术来解释。因此，除非有相反的指示，否则本说明书和所附权利要求中提出的数值参数是近似值，其可以根据寻求获得的性质而变化。尽管阐述实施方式的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是尽可能精确地报告了具体实施例中阐述的数值。然而，任何数值本质上都包含由于实验、测试测量、统计分析等的变化而产生的某些误差。

实施例的合成、生物活性及表征：

如本文描述的所有化合物均根据表2至表5所示的方法制备。为每个实施例提供了通过质谱和NMR获得的表征数据。所述化合物在生物实验部分描述的测定中进行测试。用于报告生物数据的惯例在各个表中作为脚注提供。

一般合成方法A：

可商购获得的2,6-二氟-3-硝基苯甲酸A-1(方案A)可经由Curtius反应按照J.Med.Chem.2003,46,1905中所述的程序转化为氨基甲酸酯A-2。使用氢气和催化剂(例如碳载钯金属或碳载氢氧化钯(皮尔曼催化剂))催化氢解硝基芳烃A-2，生成苯胺A-3。苯胺A-3与磺酰化剂、例如磺酰氯在可用作溶剂的有机碱、例如吡啶的存在下，在有或没有催化剂、例如4-二甲基氨基吡啶的情况下，以及在存在或不存在附加溶剂、例如二氯甲烷或四氢呋喃的情况下反应，产生磺酰胺中间体A-4，其可以使用强酸(例如无水盐酸的二噁烷溶液)将其脱保护成苯胺盐，例如A-5。替选地，可以使用乙酰化剂、例如乙酸酐将2,6-二氟苯胺A-6转化为其乙酰苯胺A-7，并转化为单保护的二苯胺A-8，如WO 2012/101238A1中所述。磺酰化为磺酰胺A-9是在与将氨基甲酸酯A-3转化为磺酰胺A-4所用的类似条件下，在有机碱(例如吡啶)的存在下，在有或没有催化剂(例如4-二甲氨基吡啶)和溶剂(例如二氯甲烷或四氢呋喃)的情况下，使用磺酰化试剂实现的。在共溶剂、例如醇的存在下用盐酸水溶液处理乙酰苯胺A-9得到苯胺盐A-5。

方案A

8-氯-2-(甲硫基)嘧啶并嘧啶A-10可商购或可如WO 2012/101238A1中所述制备。通式I的抑制剂通过A-10和苯胺衍生物A-5之间的亲核取代制备，遵循与WO 2012/101238A1中描述的类似程序。通式II的抑制剂是由通式I的抑制剂通过两步程序制备的，该程序包括首先将硫代甲基基团总体上氧化为相应的甲基亚砜和甲基砜的混合物，其然后与亲核试剂(例如1°胺或2°胺、醇、苯酚或含NH的杂环等)反应，遵循与WO 2012/101238A1中描述的类似程序。后一步通常在碱(例如有机碱，例如DIEA、三甲胺、吡啶等)的存在下，在溶剂(例如DMSO或NMP)中，在70℃至140℃的温度范围内进行。

一般合成方法B：

制备本发明抑制剂的替选方法在方案B中描述。如方案B中所示，中间体A-2(在方案A中描述并如J.Med.Chem.2003，46，1905中所述制备)通过在酸性条件下(例如HCl在二噁烷或TFA中)裂解氨基甲酸酯保护基团而转化为硝基苯胺盐酸盐B-1。氯嘧啶并嘧啶A-10(如方案A中所述制备(WO 2012/101238A1))在类似于WO 2012/102138A1中所述的条件下用苯胺盐(例如B-1)或优选用苯胺游离碱进行亲核取代，以提供中间体B-2。然后，在酸性条件下，在50°至100℃的温度范围内，在溶剂(例如MeOH、EtOH或EtOAc等)中，使用本领域技术人员建立良好的且熟知的方法，例如氯化锡(II)、铁或锌粉末，将中间体B-2的硝基官能团还原为相应的苯胺B-3。然后如方案A中所述使用磺酰氯在碱性条件下将苯胺B-3磺酰化以提供通式I的抑制剂。然后如方案A所述将通式I的抑制剂转化为通式II的抑制剂。

方案B

一般合成方法C：

制备具有通式III和通式IV的本发明抑制剂的替选方法在方案C中描述。如方案C中所示，如方案B中所述制备的中间体B3可以通过在有机碱如3°胺(例如三甲胺、DIEA等)的存在下，用磺酰氯处理而转化为氯磺酰苯胺C-1。中间体C-1与1°胺或2°胺、例如吡咯烷衍生物反应，以提供通式III的抑制剂。然后通过两步程序获得通式IV的抑制剂，该两步程序涉及将硫代甲基基团氧化为亚砜和砜的混合物，然后将其与亲核试剂反应，如方案A所述。

方案C

一般合成方法D：

按照方案D中所示的顺序制备通式V的抑制剂的实施例。

方案D

2,4,8-三氯嘧啶并嘧啶D-1通过ACS Med.Chem.Lett.2011,2,538中描述的方法制备，并如WO 2010/026262A1中所述通过用氨处理转化为4-氨基-2,8-二氯嘧啶并嘧啶D-2。二氯嘧啶并嘧啶D-2在方案A中描述的一般条件下用通式A-5的苯胺盐进行区域选择性亲核置换，以提供8-氯嘧啶并嘧啶中间体D-3。氯嘧啶并嘧啶D-3通过亲核试剂、例如2°胺或含NH的杂环进行第二次置换，遵循与WO 2012/101238A1中所描述的类似方案，以提供通式V的抑制剂。后一步通常在碱(例如有机碱，例如DIEA、三甲胺、吡啶等)存在下，在溶剂(例如DMSO或NMP)中，在70℃至140℃的温度范围内进行。替选地，中间体D-3在有机配体(例如外消旋BINOL)和无机碱(例如碳酸铯)的存在下，在铜催化的交叉偶联条件下与亲核试剂、例如2°胺或含NH的杂芳基(例如咪唑、苯并咪唑等)反应。这些反应通常在溶剂(例如DMSO或NMP)中进行，温度范围为80℃至140℃。涉及金属催化过程的将氯嘧啶偶联到这种亲核试剂的其他方法是本领域技术人员熟知的，并且可以用于获得通式V的抑制剂。

一般合成方法E：

通式VI的抑制剂如方案E中所述制备。通式I的中间体首先按照一般方法A或B制备，然后氧化成甲基亚砜和甲基砜的混合物，如一般方法A中所述。然后按照与WO 2012/101238A1中所描述的类似方案，将中间体I偶联到3-吲哚羧酸酯(例如，甲酯，X＝CH)或3-吲唑羧酸酯(例如，甲酯，X＝N)。后一步通常在碱(例如有机或无机碱，例如Cs

方案E

一般合成方法F：

按照方案F中所述的一般程序，在步骤1中将按照一般方法A或B所述制备的硫甲基中间体I氧化成甲基亚砜和甲基砜的混合物，如一般方法A所述。在步骤2中，分别按照Org.Lett.2011,13,3588中所述制备3-吲哚磺酰氯，并在有机碱(例如DIEA、三甲胺等)存在下在溶剂(例如THF)中与胺缩合以提供中间体3-吲哚磺酰胺中间体F-1。替选地，在用无机碱水溶液(例如KOH)处理除去甲苯磺酰基保护基团后，将N-甲苯磺酰基保护的吲哚-3-磺酰氯(通过在Chemical and Pharmaceutical Bulletin 2009,57,591中描述的方法制备)在溶剂(例如THF)中和在叔碱(例如DIEA或三乙胺)的存在下与伯胺或仲胺反应以提供中间体磺酰胺F-1。然后按照与WO 2012/101238A1中所描述的类似方案，将中间体F-1与来自步骤1的中间体I的氧化混合物缩合。后一步通常在碱(例如有机碱，如DIEA、三甲胺、吡啶等)的存在下，在溶剂(例如DMSO或NMP)中，在70℃至140℃的温度范围内进行，以提供通式VII的抑制剂。

X＝H或T

一般合成方法G：

3-吲哚硫氰酸酯G-1(按照Phosphorus,Sulfur and Silicon and the RelatedElements 2014,189,1378中所述的程序制备)使用还原剂、例如九水合硫化钠还原为相应的硫化物盐，并在不与烷基卤化物分离的情况下直接烷基化以提供硫化物中间体G-2。然后使用氧化剂、例如3-氯过氧苯甲酸将硫化物中间体G-2转化为砜中间体G-3。然后以所述的通常方式获得通用结构VIII的最终抑制剂。

方案G

一般合成方法H：

可商购得到的3-氟-2-硝基苯胺H-1的亮红色溶液在溶剂(例如MeCN、DMSO或NMP)中并且在无机碱(例如碳酸钾)或有机碱(例如DIEA)的存在下与伯胺或仲胺反应，在热或微波条件下、在40℃至120℃的温度范围内加热，以提供中间体H-2。中间体H-2的硝基的还原可以在氯化铵存在下在醇溶剂(例如异丙醇)中，在40℃至80℃的温度范围内使用金属(例如Fe或Zn)实现。然后1,2-苯二胺中间体在40℃至80℃的温度下与甲酸在加热后，直接转化为所想要的苯并咪唑中间体H-3。然后，在前文描述的通常条件下，从中间体苯并咪唑H-3和I获得通用结构IX的最终抑制剂。

方案H

一般合成方法I：

在氯化铵存在下，在40℃至80℃的温度范围内，在醇溶剂(例如异丙醇)中，使用金属(例如Fe或Zn)将根据一般合成方法H获得的硝基苯胺H-2还原为1,2-苯二胺I-1。1,2-苯二胺中间体I-1然后在酸性条件(例如AcOH)下用无机亚硝酸盐、例如亚硝酸钠处理后转化为所想要的苯并三唑中间体I-2。然后，在前文描述的通常条件下，从中间体I-2和I获得通用结构X的最终抑制剂。

方案I

磺酰氯：

以下磺酰氯获自商业来源并按原样使用：4-甲氧基苯磺酰氯、2,4-二氯苯磺酰氯、2,4-二甲基苯磺酰氯、2-氯苯磺酰氯、2-甲基苯磺酰氯、4-乙基苯磺酰氯、2-氰基苯磺酰氯、2,4-二甲氧基苯磺酰氯、2-三氟甲基苯磺酰氯、3-氯苯磺酰氯、3-甲基苯磺酰氯、2,3-二氯苯磺酰氯、3-氯-2-甲基苯磺酰氯、2-溴苯磺酰氯、2-氯-4-氟苯磺酰氯、2-氯-6-氟苯磺酰氯、2,5-二氯苯磺酰氯、2,5-二甲基苯磺酰氯、2-氯-6-甲基苯磺酰氯、3-氟-2-甲基苯磺酰氯、2-氯-4-甲基苯磺酰氯、1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-磺酰氯、2-氯-4-(三氟甲基)-苯磺酰氯、2-甲基-4-硝基苯磺酰氯、2-(二氟甲基)苯磺酰氯。

其他磺酰氯通过使用或采用如下所述的文献程序来制备。

2-氟-4-甲氧基苯磺酰氯：

按照EP2752410A1中所述的程序，将2-氟-4-甲氧基苯胺(1.00g,7.1mmol)溶解于乙腈(25mL)，并添加浓HCl(10mL)。将混合物在冰-盐浴中冷却至0℃。然后分批添加NaNO

使用类似程序制备以下磺酰氯：

2-氰基-4-氟苯磺酰氯：使用2-氰基4-氟苯胺为起始材料制备。粗材料是高度不纯的，但已成功用于磺酰化反应。

4-甲氧基-2-三氟甲基苯磺酰氯：使用4-甲氧基-2-三氟甲基苯胺制备：

4-氯-2-甲基苯磺酰氯：

按照Acta Crystallographica Section E 2009,65(4),o800中所述的程序，通过间氯甲苯的氯磺酰化来制备。将间氯甲苯(1mL)溶解于CHCl

使用类似的程序并进行一些修改来制备以下磺酰氯，如下所述：

4-甲氧基-2-甲基苯磺酰氯：

将3-甲氧基甲苯(6.00g)溶解在CHCl

2-氯-4-甲氧基苯磺酰氯：

将3-氯苯甲醚(1.00g)溶解在CHCl

2,3-二甲基苯磺酰氯：

如WO2003/055478中所述，在邻二甲苯的氯磺酰化后作为次要异构体分离。

3-氟-2-甲基-4-甲氧基苯磺酰氯：

步骤1：向2-氟-3-甲基苯酚(4.32mL，39.7mmol)在丙酮(50mL)中的溶液中添加碳酸钾(6.58g，47.6mmol)，随后添加碘甲烷(2.75mL，43.7mmol)。然后将反应混合物在60℃下回流过夜。然后将反应混合物冷却至室温，过滤(2x 10mL丙酮用于冲洗)并减压浓缩。将粗产物从水(30mL)和EtOAc(2×50mL)中萃取。然后分离有机层，用Na

步骤2：在5分钟期间内向来自步骤1的2-氟-3-甲基苯甲醚(1.00g,7.13mmol)在DCM(5.6mL)中的溶液中添加氯磺酸(1.13mL,16.5mmol)在DCM(5.6mL)中的溶液。将含有粘性液体层的浅褐色反应混合物在室温下搅拌10分钟，然后通过倒入水(10mL)和冰(5g)的混合物中淬灭。将水相用DCM(2×10mL)萃取，在Na

3-氯-2-甲基-4-甲氧基苯磺酰氯：

按照与3-氟-2-甲基-4-甲氧基苯磺酰氯类似的程序(步骤1)并从2-氯-3-甲基苯酚开始，以定量产率获得呈无色液体的2-氯-3-甲基苯甲醚：

如对于3-氟-2-甲基-4-甲氧基苯磺酰氯所述的用氯磺酸处理(步骤2)提供了产率为96％的呈无色液体的所想要的3-氯-2-甲基-4-甲氧基苯磺酰氯：

2-乙基苯磺酰氯：

将2-乙基苯硫酚(1.46mL,10.3mmol)和KCl(776mg,10.3mmol)溶解于水(38mL)中并分小份添加

3-氟-2-乙基苯磺酰氯：

步骤1：将2-溴-6-氟苯甲醛(6.00g，29.5mmol)溶解在无水THF(60mL)中，并将溶液在氩气氛下冷却至-78℃。滴加甲基溴化镁(3.0M于二乙醚中的溶液，13.4mL，40.3mmol)并将混合物在-78℃下搅拌30分钟。然后将反应物用10％盐酸(50mL)淬灭并将产物萃取到乙醚(2×50mL)中。将萃取物干燥(MgSO

步骤2：将氯化铟(III)(412mg,1.83mmol)混悬于DCM(40mL)中并添加氯二异丙基硅烷(8.42mL,49.3mmol)。添加于DCM(8mL)中的来自步骤1的醇(4.00g，18.3mmol)，并将混合物在RT下搅拌3h，得到澄清溶液。将反应混合物用水(50mL)淬灭，用二乙醚(3×20mL)萃取，用盐水洗涤并干燥(MgSO

将该物质溶解在DCE(41mL)中，并添加氯二异丙基硅烷(0.78mL，4.6mmol)和氯化铟(III)(103mg，4.6mmol)。将混合物在80℃下搅拌3小时。冷却至环境温度后，将反应混合物用己烷(100mL)稀释，用水(100mL)洗涤，并用己烷(2x 50mL)反萃取水相。将合并的有机相干燥(Na

步骤3：将来自步骤2的芳基溴(3.71g,18.3mmol)溶解在甲苯(60mL)中并添加N,N-二异丙基乙胺(6.40mL,36.5mmol)。然后通过3次抽空和回填氮气的循环对溶液进行脱气。添加三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(836mg,0.9mmol)、4,4-双(二苯基膦基)-9,9-二甲基呫吨(1.08g,1.83mmol)和2-乙基己基-3-巯基丙酸酯(4.59mL,19.2mmol)，并将混合物再脱气两次，然后在氮气氛下回流过夜。然后将反应混合物冷却至室温，用水(50mL)淬灭并用EtOAc(2×50mL)萃取。将合并的有机相用10％ HCl水溶液(75mL)洗涤并干燥(Na

步骤4：将来自步骤3的粗硫化物衍生物(4.00g，假定11.7mmol)溶解在THF(41mL)中并滴加叔丁醇钾(1.0M于THF中，14.1mL，14.1mmol)。将所得溶液在室温下搅拌1小时。然后将反应物通过添加饱和NH

步骤5：将来自步骤4的苯硫酚和二硫化物的粗混合物(1.50g，假定为9.6mmol)和KCl(723mg(9.6mmol))悬浮于水(40mL)中，并分批添加

3-氯-2-乙基苯磺酰氯：

按照与3-氟-2-乙基苯磺酰氯相同的程序，但以2-溴-6-氯苯甲醛开始制备磺酰氯：

步骤1(98％产率，呈白色固体)：

步骤2(100％产率，呈无色油状物)：

步骤3(81％产率，呈橙色油状物)：

步骤4(99％产率，呈无色液体)：

步骤5(不经纯化而使用的粗材料)：

2-甲基-3-(三氟甲基)苯磺酰氯：

按照与3-氟-2-乙基苯磺酰氯相同的程序，但以可商购获得的2-甲基-3-(三氟甲基)溴苯开始制备磺酰氯：

步骤3(100％产率，呈橙色油状物)：

步骤4(定量产率，呈无色油状物)：

步骤5(定量产率，呈白色固体)：

用于从芳基溴制备磺酰氯的一般程序：

步骤1：将芳基溴1(1.00mmol)于甲苯(1.70mL)中稀释。将混合物用氮气鼓泡通过溶液5分钟来脱气。添加三(二亚苄基丙酮)-二钯(0)(0.02mmol)、4,4-双(二苯基膦基)-9,9-二甲基呫吨(0.04mmol)和N,N-二异丙基乙胺(2.0mmol)，然后将混合物再次脱气5分钟。然后加入苄硫醇(1mmol)并将所得混合物加热回流过夜(油浴T＝115℃)。完成后，将反应物冷却至室温，用EtOAc(20mL)稀释并用H

步骤2：将化合物2(1.00mmol)溶解在乙酸(1.90mL)中并添加H

2-氯-3-甲基苯磺酰氯：

/>

磺酰氯按照一般程序从可商购获得的1-溴-2-氯-3-甲基苯开始制备。

苄基(2-氯-3-甲基苯基)硫化物：黄色固体，51％产率，95％纯度(在220nm下)。(ES

2-氯-3-甲基苯磺酰氯：淡黄色油状物，70％产率，60％纯度(在254nm下)。LCMS：将LCMS样品用N-甲基哌嗪淬灭(所得磺酰胺MW＝288.8)，(ES

3-氟-2-(三氟甲基)苯磺酰氯：

磺酰氯按照一般程序从可商购获得的1-溴-3-氟-2-(三氟甲基)苯开始制备：

苄基(3-氟-2-(三氟甲基)苯基)硫化物：黄色油状物，66％产率，98％纯度(在254nm下)。(ES

3-氟-2-(三氟甲基)苯磺酰氯：淡黄色油状物，93％产率，98％纯度(在254nm下)。将LCMS样品用N-甲基哌嗪淬灭(所得磺酰胺MW＝326.1)，(ES

3-氯-2-(三氟甲基)苯磺酰氯：

磺酰氯按照一般程序从可商购获得的1-溴-3-氯-2-(三氟甲基)苯开始制备：

苄基(3-氯-2-(三氟甲基)苯基)硫化物：白色固体，59％产率，90％纯度(在220nm下)。(ES

3-氯-2-(三氟甲基)苯磺酰氯：无色油状物，66％产率。LCMS：将LCMS样品用N-甲基哌嗪淬灭(所得磺酰胺MW＝343.5)，(ES

3,4-二氟-2-甲基苯磺酰氯：

磺酰氯按照一般程序从可商购获得的1-溴-3-氯-2-(三氟甲基)苯开始制备：

苄基(3,4-二氟-2-甲基苯基)硫化物：橙色油状物，96％产率，96％纯度(在254nm下)。(ES

2,4-二甲基-3-氟苯磺酰氯：

按照一般程序从可商购获得的1-溴-2,4-二甲基-3-氟苯开始制备磺酰氯：

苄基(3-氟-2,4-二甲基苯基)硫化物：橙色油状物，95％产率的粗品，80％纯度(在254nm下)，作为粗品使用。

3-氟-2,4-二甲基苯-1-磺酰氯：橘色油状物，89％产率的粗品，74％纯度(在254nm下)。LCMS：将LCMS样品用N-甲基哌嗪淬灭(所得磺酰胺MW＝286.4)，(ES

2-甲基吡啶-3-磺酰氯：

按照一般程序从可商购获得的3-溴-2-甲基吡啶开始制备磺酰氯：

3-(苄硫基)-2-甲基吡啶：橙色液体，88％产率，94％纯度(在220nm下)。(ES

2-甲基吡啶-3-磺酰氯：淡黄色油状物，100％产率，95％纯度(在254nm下)。将LCMS样品用H

6-甲氧基-4-甲基吡啶-3-磺酰氯：

2-乙基己基3-((6-甲氧基-4-甲基吡啶-3-基)硫代)丙酸酯(2)的制备：将5-溴-2-甲氧基-4-甲基吡啶(6.00g,29.7mmol)溶解于甲苯(100mL)中，并添加N,N-二异丙基乙胺(10.4mL,59.4mmol)。将混合物用氮气鼓泡通过溶液5分钟来脱气。添加三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(1.36g,1.49mmol)、4,4-双(二苯基膦基)-9,9-二甲基呫吨(1.75g,2.97mmol)和2-乙基己基-3-巯基丙酸酯(7.47mL,31.2mmol)。将混合物再次脱气5分钟。将混合物加热回流过夜(油浴T＝117℃)。将反应物冷却至室温，用EtOAc(100mL)稀释并用H

6-甲氧基-4-甲基吡啶-3-硫醇(3)的制备：向2(10.0g,29.5mmol)于THF(105mL)中的-78℃溶液滴加叔丁醇钾(1.00M于THF中，35.3mL,35.3mmol)，并形成沉淀。将所得混悬液在-78℃下搅拌30分钟。将反应物通过添加NH

6-甲氧基-4-甲基吡啶-3-磺酰氯(4)的制备：向硫醇3(4.56g,29.4mmol)在H

3-甲基吡啶-4-磺酰氯：

步骤1：将4-溴吡啶(1.00mmol)溶解于甲苯(1.70mL)中，并添加N,N-二异丙基乙胺(2.00mmol)。将混合物用氮气鼓泡通过溶液5分钟来脱气。添加三(二亚苄基丙酮)-二钯(0)(0.02mmol)、4,4-双(二苯基膦基)-9,9-二甲基呫吨(0.04mmol)和苯基甲硫醇/苄硫醇(1.00mmol)。将混合物再次脱气5分钟。将混合物加热回流18h(油浴T＝115℃)。将反应物冷却至室温，用EtOAc(10.0mL)稀释并用H

步骤2：将化合物2(1.00mmol)溶解于CH

2,3-二甲基吡啶-4-磺酰氯：

使用与3-甲基吡啶-4-磺酰氯相同的程序，从2,3-二甲基-4-溴吡啶开始：

步骤1：4-(苄硫基)-2,3-二甲基吡啶(2)：(92％产率)。LCMS:(ES

步骤2：2,3-二甲基吡啶-4-磺酰氯(3)：将LCMS样品用N-甲基哌嗪淬灭(所得磺酰胺MW＝269.3)；(ES

片段B69的受保护的磺酰氯：

步骤1：向可商购获得的氨基吡啶(1.00g,4.27mmol)和N-苄基氨基甲酰氯(0.9421g,5.5546mmol)于EtOAc(20mL)中的溶液中添加20mL的饱和NaHCO

步骤2：将来自步骤1的碘吡啶(0.61g,1.66mmol)、三(二亚苄基丙酮)-二钯(0)氯仿加合物(86mg,0.0828mmol)、9,9-二甲基-9h-呫吨-4,5-二基)双(二苯基膦)(96mg,0.166mmol)、DIPEA(0.576mL,3.31mmol)和苄基硫醇(0.233mL,1.99mmol)于甲苯(15mL)中的脱气溶液在N

步骤3：向来自步骤2的硫化物(300mg,0.823mmol)于含90％ AcOH的水(16mL)中的溶液中添加N-氯代琥珀酰亚胺(330mg,2.47mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3小时。将反应混合物蒸发至干，然后在EtOAc中稀释并用水洗涤，随后用盐水洗涤。将有机层经MgSO

2,2-二氟苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-4-磺酰氯：

将亚硫酰氯(5.96mL)在20分钟内滴加到水(30mL)中，并将混合物在室温下搅拌48小时以产生含有二氧化硫的溶液。在单独的容器中，将2,2,-二氟苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-4-胺(1.00g,5.78mmol)滴加到冰冷却的浓HCl(7mL)中以产生白色沉淀。将亚硝酸钠(523mg,7.5mmol)于水(2mL)中的溶液在5分钟内滴加到苯胺盐酸盐，以产生橙色反应混合物。然后在5℃下将橙色混悬液逐渐添加到先前已添加10mg氯化亚铜的来自以上的二氧化硫溶液中。将混合物在冰浴中再搅拌2小时(观察到气体逸出并且橙色液体沉积在烧瓶底部)。在通过LCMS分析确定完成后，将反应混合物用DCM(2x 20mL)萃取，干燥(Na

4-氯-3-氟-2-甲基苯磺酰氯：

N-(3-氟-2-甲基苯基)新戊酰胺(2)的制备：经10分钟，向3-氟-2-甲基苯胺(10.9mL,93.0mmol)的THF(240mL)溶液在0℃下添加三乙胺(14.9mL,106mmol)，然后是新戊酰氯(13.1mL,105mmol)。将混合物升温至室温并搅拌2小时。减压蒸发挥发物，并将残余物在H

N-(4-氯-3-氟-2-甲基苯基)新戊酰胺(3)的制备：在室温下向化合物2(4.20g,20.1mmol)的DMF(50.0mL)溶液在10分钟内添加N-氯琥珀酰亚胺(2.76g,20.1mmol)(分3部分)。将混合物在80℃下加热90分钟。添加额外的N-氯琥珀酰亚胺(541mg,4.01mmol)并将其在80℃下搅拌45分钟。将混合物冷却至室温并用EtOAc(30mL)和水(60mL)稀释。分离有机层和水层。将水层用EtOAc(3x 20mL)萃取。将合并的有机层用H

4-氯-3-氟-2-甲基苯胺(4)的制备：经5min在室温下向化合物3(1.60g,6.57mmol)的二噁烷(18mL)溶液添加HCl(6.00M于水中，23mL,138mmol)。将混合物在100℃下加热20h。将混合物冷却至室温。分批添加固体K

4-氯-3-氟-2-甲基苯-1-磺酰氯(5)的制备：在冰冷却下，将亚硫酰氯(29.1mL,395mmol)在20分钟内滴加到H

3-甲基-2-苯硫基磺酰氯：

如美国专利3,991,081中所述，通过3-甲基噻吩的氯磺酰化制备。

3-氯-2-苯硫基磺酰氯：

将3-氯噻吩(1.00g)溶解在CHCl

4-氯-3-甲基噻吩-2-磺酰氯：

3-氯-4-甲基噻吩的制备：在100mL烧瓶中，在室温下将氯化铜(I)(5.76g,56.5mmol)添加至于DMF(20.1mL)中的3-溴-4-甲基噻吩(3.16mL,28.2mmol)。将其在油浴中在160℃下加热24小时。将粗品倒到H

4-氯-3-甲基噻吩-2-磺酰氯的制备：将3-氯-4-甲基噻吩(1.00g,7.54mmol)溶解在CHCl

3,4-二氯噻吩-2-磺酰氯：

3,4-二氯噻吩的制备：在100mL烧瓶中，在室温下将氯化铜(I)(13.9g,137mmol)添加至DMF(32mL)中的3,4-二溴噻吩(5.03mL,45.5mmol)。将其在油浴中在160℃下加热24小时。将粗品倒到H

3,4-二氯噻吩-2-磺酰氯的制备：在5分钟内向化合物2(1.61g,10.5mmol)的CHCl

(3R)-3-甲氧基1-吡咯烷磺酰氯：

遵循美国专利申请US2011/0311474A1中描述的程序，将(R)-3-甲氧基吡咯烷盐酸盐(0.30g,2.1mmol)混悬于4mL甲苯和2mL DCM的混合物中。添加三乙胺(0.64mL,4.6mmol)并将混合物超声处理4-5分钟，提供精细的白色混悬液。在单独的烧瓶中，将4mL甲苯在乙腈/干冰浴中冷却至-40℃。添加硫酰氯(0.71mL,8.7mmol)并将溶液搅拌5分钟。然后在10分钟内将吡咯烷混悬液滴加到冷(-40℃)硫酰氯溶液。将所得混悬液在相同温度下搅拌1小时，然后升温至室温。将固体滤出并用甲苯冲洗。将滤液浓缩，得到400mg呈淡褐色油状物的所想要的产物，其无需进一步纯化即使用(0.40g)。

(3S)-3-甲氧基-1-吡咯烷磺酰氯：

以与(R)-异构体类似的方式制备，但从(S)-3-甲氧基吡咯烷盐酸盐开始。

使用可商购得到的2°胺和US2011/0311474A1中描述的程序以类似方式制备的其他氨磺酰氯包括：

(S)-3-氟吡咯烷-1-磺酰氯：由(S)-3-氟吡咯烷盐酸盐获得的白色固体：

3,3-二氟吡咯烷-1-磺酰氯：由3,3-二氟吡咯烷盐酸盐获得的白色固体：

3-甲氧基氮杂环丁烷-1-磺酰氯：由3-甲氧基氮杂环丁烷盐酸盐获得：

(R)-3-(氯甲基)吡咯烷-1-磺酰氯的制备：

将(R)-3-(羟甲基)吡咯烷(200mg，2mmol)和三乙胺(0.61mL，4.35mmol)在无水DCM(15mL)中的溶液在-78℃下滴加到硫酰氯(0.48mL，5.9mmol)的DCM(5mL)搅拌溶液中。将反应物在-78℃下搅拌30分钟，然后在1小时内升温至室温。然后将反应混合物用1M盐酸水溶液(5mL)和盐水(5ml)洗涤。分离有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到无色油状物的标题化合物，将其按照原样用于实施例28的制备。

从氨基甲酸叔丁酯A-2制备二氟苯胺盐酸盐中间体A-5(Ar＝4-甲氧基苯基)。

步骤1-苯胺中间体A-3的制备：将硝基芳烃A-2(5.00g,18mmol,按照J.Med.Chem.2003,46,1905中描述的程序制备)和20％ Pd(OH)

步骤2-磺酰胺A-4(Ar＝4-甲氧基苯基)的制备：将来自步骤1的粗苯胺A-3(假设18mmol)溶解在THF(30mL)中并添加过量的4-甲氧基苯基磺酰氯(7.53g,36mmol)，随后添加吡啶(6mL)。将混合物在50℃下搅拌18h。减压去除THF，并将残余物在EtOAc和水之间分配。将萃取物用饱和NaHCO

步骤3-苯胺盐酸盐A-5的制备(Ar＝4-甲氧基苯基)：来自步骤3的粗氨基甲酸酯A-4(8.16g)在室温下在4N HCl的二噁烷溶液(25mL)中搅拌1.5小时，在此期间米色固体逐渐沉淀。1.5小时后，添加另外10mL的4N HCl的二噁烷溶液，并继续搅拌另外1小时。然后用50mL二乙醚稀释反应混合物，并将米色沉淀物通过过滤收集，用醚洗涤并在真空下干燥。由硝基芳烃A-2获得呈纯形式的苯胺盐A-5(4.38g)，总产率为68％：

从乙酰苯胺A-8制备二氟苯胺盐酸盐中间体A-5(Ar＝2,3-二氯苯基)。

乙酰苯胺A-8的制备：按照Bioorg.Med.Chem.2016,24,2215中所述的文献程序，乙酰苯胺A-7可以通过用乙酸酐对2,6-二氟苯胺A-6进行乙酰化来制备。如WO 2012/101238A1中所述，通过顺序硝化然后将硝基基团还原为苯胺，将中间体A-7转化为乙酰苯胺A-8。

步骤1-磺酰胺A-9(Ar＝2,3-二氯苯基)的制备：将苯胺A-8(8.50g,45.5mmol)溶解于THF(145mL)中，并将吡啶(4eq.,14.7mL)添加至褐色溶液，然后添加2,3-二氯苯磺酰氯(1.2eq.,13.45g)。将所得反应混合物在45℃下搅拌3.5小时，之后如通过LCMS监测判断转化完成。将反应混合物冷却至室温，然后在EtOAc和2-Me-THF(1:1)与水之间分配。添加1NHCl溶液直至获得弱酸性pH。双相混合物中存在大量灰白色固体，并将其滤出(第一批)。分离滤液层，并将水层用EtOAc萃取两次以上。将合并的有机萃取物用水洗涤一次，然后用盐水洗涤，经MgSO

步骤2-苯胺盐酸盐A-5(Ar＝2,3-二氯苯基)的制备：在500mL圆底烧瓶中，将乙酰苯胺A-9(7.00g,17.7mmol)混悬于乙醇(65mL)中，并添加浓HCl和水(65mL)的1:1混合物。烧瓶配备有塞子的回流冷凝器并在搅拌下在80℃下加热。24小时后，根据LCMS监测判断转化率为～70％。将另外的EtOH(65mL)和6N HCl(65mL)加入混悬液中并在80℃下继续搅拌7小时以上，之后LCMS表明完全转化为所想要的苯胺。将反应混合物趁热用50mL水稀释并通过棉塞过滤以除去少量不溶材料。然后将其减压浓缩至干。通过在减压下蒸发甲苯3次将残余物共沸干燥，然后在真空下干燥，得到7.2g呈黄色固体形式的HCl盐形式的所想要的产物A-5：

表1

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一般合成方法A-从中间体A-5制备抑制剂I和抑制剂II(实施例1和实施例36)：

步骤1(实施例1的制备)：将氯嘧啶A-10(0.546g，1.25当量)和苯胺盐酸盐A-5(Ar＝4-甲氧基苯基；0.750g，1当量)溶于AcOH(10mL)中，并将褐色溶液在50℃下搅拌1h。LCMS显示完全转化为所想要的粗产物(实施例1)。将反应混合物冷却至RT并用水(50mL)稀释，产生通过过滤收集的灰色沉淀物，用水洗涤并在真空下干燥。通过使用1:1hex/EA作为洗脱液通过硅胶小垫(3mL)来纯化100mg粗材料样品，以去除有色的基线材料。从浅紫红色溶液中除去挥发物后，将该材料从MeCN-水中冻干，以提供实施例1的抑制剂(73mg)。

步骤2和步骤3(实施例36的制备)：在室温下向粗硫代甲基衍生物(实施例1；355mg，0.72mmol，1当量)在7mL DCM中的溶液中加入m-CPBA(185mg，1.07mmol，1.5当量)。将混合物在该温度下搅拌1h。LCMS显示完全转化为亚砜和砜的80:20混合物。将混合物浓缩以除去大部分DCM，然后将其放入EtOAc中并用NaHCO

将上述亚砜和砜的粗混合物(25mg，0.05mmol)和苯并咪唑(12mg，0.1mmol，2当量)装入4mL小瓶中并溶解在NMP(1mL)中。然后加入DIEA(43μL，0.25mmol，5当量)，并将所得混合物在60℃下搅拌19小时(LCMS显示完全反应)。通过加入0.2mL AcOH来淬灭反应，然后用甲醇稀释至2mL。过滤溶液，然后通过制备型HPLC(MeOH/H

以类似方式制备的通式I和通式II的抑制剂的其他实施例连同表征数据列于表1和表2中。

使用一般合成方法B合成抑制剂I和抑制剂II(实施例12和实施例56)：

步骤1：将氨基甲酸酯A-2(1.50g)溶于DCM(5mL)中，并加入TFA(2mL)。在室温下搅拌2小时后，脱保护完成(LCMS)，浓缩反应混合物并在减压下干燥。

步骤2：虽然来自步骤1(上述)的粗TFA盐可以直接用于步骤2中，但所想要的中间体B-2被不同量的由A-10的溶剂分解得到的8-羟基-2-硫代甲基嘧啶并嘧啶污染。如果苯胺TFA盐在如下与A-10反应之前被中和为游离苯胺，则可以使这种副反应最小化，并且获得更干净的中间体B-2。将来自步骤1的粗TFA盐溶于DCM中，并用NaHCO

将氯嘧啶并嘧啶A-10(550mg，2.6mmol)和B-1苯胺游离碱(0.39g，2.25mmol)溶于乙酸(7mL)中，并将混合物在55℃下搅拌1小时。LCMS显示完全转换为所想要的产物。将反应混合物冷却至RT并用三倍体积的水稀释，使产物沉淀为奶油色固体。通过过滤收集材料，用水洗涤并在真空下干燥(0.58g)：

步骤3：将硝基芳烃B-2(0.86g，2.45mmol)和二水合氯化锡(II)(2.7当量，6.6mmol，1.49g)混悬在无水乙醇(10mL)中，并将混合物在65℃下搅拌3小时。将反应混合物在1N NaOH和EtOAc之间分配。有机萃取物用NaHCO

母液通过使用10％-70％EtOAc在己烷中的快速色谱(30mL)纯化(Rf＝0.3，在1:2hex-EA中)，以提供额外的96mg苯胺B-3。

步骤4(实施例12)：将苯胺B-3(25mg，0.078mmol)和4-甲氧基-2-甲基苯磺酰氯(100mg，0.23mmol，3当量)溶于THF(1mL)中，并加入吡啶(40μL)。将混合物在45℃下搅拌1小时(LCMS显示转化率为50％)。加入另一部分磺酰氯(100mg)，并在45℃下继续搅拌18小时(LCMS显示完全转化)。用TFA(100μL)酸化反应混合物，并用DMSO稀释至1.8mL。使用30％-100％ MeOH+0.1％ HCOOH梯度(13mg)通过制备型HPLC分离产物(实施例12)。

步骤5和步骤6(实施例56)：在室温下向硫代甲基嘧啶(实施例12，300mg，0.59mmol)在DCM(5mL)中的混悬液中加入1.2当量的m-CPBA(160mg，0.71mmol)。混合物在10分钟内变成黄色溶液。将其在室温下搅拌总共45分钟，此时LCMS显示反应完成。将混合物浓缩以除去大部分DCM，然后在EtOAc和NaHCO

将4,5-二甲基-1H-咪唑盐酸盐(19mg，0.14mmol，3当量)和来自上述的亚砜-砜混合物(25mg，0.048mmol，1当量)装入4mL小瓶中，然后加入NMP(0.5mL)和DIEA(42μL，0.24mmol，5当量)。将所得混合物在60℃下搅拌4h(LCMS显示完全转化)。用AcOH(0.2mL)酸化反应混合物，并通过制备型HPLC(MeOH/H

以类似方式制备的通式I和通式II的抑制剂的其他实施例与表征数据一起列于表2和表3中。

使用一般合成方法C合成抑制剂III和抑制剂IV(实施例29和实施例73)：

步骤1：将硫酰氯(0.051ml，0.624mmol)溶于DCM(2ml)中，并将溶液冷却至-78℃。在5分钟内滴加苯胺B-3(50mg，0.156mmol)和三乙胺(0.11ml，0.78mmol)在DCM(5ml)中的溶液。将反应混合物在-78℃下搅拌90分钟，得到中间体C-1的溶液。

步骤2(实施例29)：将DCM(3mL)中的(R)-3-甲基吡咯烷盐酸盐(76mg，0.62mmol)加入中间体C-1的冷溶液中，然后加入吡啶(0.5mL)。使反应混合物升温至RT，然后搅拌2小时(LCMS显示产物的质量和反应完成)。将反应混合物蒸发至干，并与甲苯共沸以除去吡啶。使用RediSep 24g柱(DCM/EtOAc)在ISCO上纯化残留物，以提供褐色固体的实施例29的抑制剂(25mg)。

步骤3和步骤4(实施例73)：将来自步骤1的硫代甲基嘧啶(实施例29，20mg，0.043mmol)溶于DCM(5mL)中，并加入m-CPBA(11.5mg，0.051mmol)。将混合物在RT下搅拌30分钟(LCMS不再显示起始材料)。将反应混合物用25mL二氯甲烷稀释，并用饱和NaHCO

将上述粗材料(18mg，0.037mmol)溶于NMP(2mL)中，并加入DIEA(0.033ml，0.186mmol)和苯并咪唑(13.2mg，0.112mmol)。将反应混合物在60℃下加热3h(LCMS显示完全转化)。用MeOH(1mL)稀释反应混合物，用几滴乙酸酸化，并使用30％-100％ MeOH-水-0.1％TFA梯度通过制备型HPLC分离产物。将产物级分部分蒸发，溶解在ACN和水中并冻干，得到实施例73(12mg)。

以类似方式制备的通式I和通式II的抑制剂的其它实施例连同表征数据列于表2和表3中。

使用一般合成方法D合成抑制剂V(实施例88)：

步骤1：将氨基-二氯嘧啶并嘧啶D-2(50mg，0.23mmol，1当量)和苯胺盐酸盐A-5(85mg，0.23mmol，2当量)溶于AcOH(1.5mL)中，并将混合物在55℃下搅拌1小时(LCMS显示转化为产物，但仍有少量苯胺残留)。再加入10mg二氯衍生物D-2，并在55℃下继续搅拌30分钟。冷却至室温，用3倍体积的水稀释，收集奶油色沉淀，用水洗涤并在真空下干燥(120mg)：

步骤2：将氨基-氯嘧啶(25mg，0.05mmol，1当量)和苯并咪唑(10.5mg，0.09mmol，1.8当量)混悬在DMSO(0.7mL)中，加入碳酸铯(37mg，0.11mmol、2.3当量)，然后加入铜粉(0.3mg，0.1当量)和外消旋的BINOL(1.5mg，0.1当量)。将混合物在110℃下搅拌2小时(LCMS显示完全转化为所想要的质量)。用TFA(100μL)酸化褐色反应混合物，并通过制备型HPLC使用30％-100％ MeOH/0.1％ HCOOH梯度分离产物。实施例88的抑制剂(10mg)在冷冻干燥后分离为米色固体。以类似的方式制备实施例85、实施例86和实施例87。

在实施例84的情况下，如方案A和方案B的最后一步所述，在碱性条件下使用亲核置换形成产物(中间体D-3、4当量的DIEA和2当量的3-氟吡咯烷盐酸盐在NMP中在100℃下加热1.5小时)。

以类似方式制备的通式V的抑制剂的其他实施例与表征数据一起列于表4中。

使用一般合成方法E合成抑制剂VI：

步骤1：将由合适的中间体A-5制备的中间体I(Ar＝3-氟-2-甲基苯基，实施例90)氧化成亚砜和砜的混合物，如一般合成方法A的步骤1和步骤2中所述。

步骤2和步骤3(X＝CH)：将碳酸铯(1.16g，3.51mmol)和甲基吲哚-3-羧酸酯(X＝CH；0.554g，3.1mmol)混悬在DMSO(62mL)中，并将混合物在RT下搅拌10分钟。加入来自步骤1的亚砜和砜的混合物(1.55g，2.95mmol)，并将该混合物在80℃下搅拌18小时，此时通过LCMS分析判断转化完成。

将NaOH(236mg，5.9mmol)加入来自步骤2的反应混合物中，并在RT下搅拌该混合物直到完全转化为通过LCMS分析确定的所想要的羧酸中间体E-1(X＝CH)。然后加入柠檬酸溶液(1M)沉淀产物，过滤、水洗并干燥，得到褐色固体的E-1(X＝CH)(1.67g，93％产率)：

步骤2和步骤3(X＝N)：将叔丁氧基钠(341mg，3.54mmol)加入到无水THF(6.2mL)中的1H-吲唑-3-羧酸甲酯(573mg，3.19mmol)中，并将混合物在RT下搅拌10分钟。加入来自步骤1的亚砜/砜混合物(1.55g，2.95mmol)，当LCMS分析判断转化完成时，将混合物在室温下搅拌18小时。将反应混合物在减压下浓缩至20mL的体积，并加入NaOH(236mg，5.9mmol)在水(20mL)中的溶液。混合物在室温下搅拌4h，此时通过LCMS分析完成向所想要的羧酸的转化。将反应混合物在减压下浓缩以除去THF，含水残留物用1M柠檬酸酸化以沉淀产物，通过过滤收集产物，用水洗涤并干燥以定量产率得到褐色固体的E-1(X＝N)：

步骤4(实施例103的制备，X＝CH)：将羧酸E-1(X＝CH；61mg，0.1mmol)和(S)-3-羟基哌啶盐酸盐(17mg，0.12mmol)溶于DMF(0.5mL)中，加入DIPEA(61μL，0.35mmol)，然后加入HATU(58mg，0.15mmol)。将混合物在环境温度下搅拌18小时。然后通过制备型反相HPLC直接纯化反应混合物，以在冷冻干燥后提供黄色粉末的实施例103的化合物。

表3中列出的其他实施例(X＝CH或N)并使用方法E以类似的方式制备。

使用一般合成方法F合成抑制剂VII(实施例95)：

步骤1：按照Org.Lett.2011,13,3588所述制备3-吲哚磺酰氯。将磺酰氯(200mg，0.9mmol)装入25mL烧瓶中，向烧瓶中加入THF(4mL)，然后加入二甲胺盐酸盐(2当量，150mg，1.9mmol)和DIEA(4当量，0.65mL，3.7mmol)。溶液很快变成淡黄色，底部沉积黄色粘性油状物。在RT下搅拌20分钟后(LCMS显示磺酰氯完全消耗)。将混合物在EtOAc和NH

步骤2：如一般方法A所述，将硫代甲基衍生物I(Ar＝3-氟-2-甲基苯基；实施例90)氧化成亚砜和砜的混合物。

步骤3(实施例95)：由来自步骤1的吲哚磺酰胺和来自步骤2的亚砜/砜混合物使用通用方法A制备。

表3中列出的其他实施例以类似的方式使用一般方法F制备。

使用一般合成方法G合成抑制剂VIII(实施例142)：

步骤1：向1H-吲哚-3-基硫氰酸酯(Phosphorus,Sulfur and Silicon and theRelated Elements2014,189,1378)(100mg，0.57mmol)在iPrOH(5mL)中的溶液中加入溶解在0.5mL水中的九水硫化钠(414mg，1.72mmol)，然后将所得混合物在50℃下搅拌2小时。此后，加入4-氯四氢吡喃(0.19mL，1.72mmol)，并在50℃下搅拌过夜。将反应混合物用EtOAc(30mL)稀释并分离。将有机层用水(15mL)洗涤，然后用盐水(15ml)洗涤，用MgSO

步骤2：将来自步骤1的硫化物溶解在DCM中，加入3-氯过氧苯甲酸(297mg，1.72mmol)并在室温下搅拌2h。完成后，通过加入10mL饱和NaHCO

步骤3(实施例142)：使用一般方法A所述的程序将来自步骤2的吲哚偶联至中间体I(Ar＝2，3-二氯苯基)。

在步骤1中使用合适的烷基化剂以类似方式制备的抑制剂的其他实施例在方法F下列于表3中。

使用一般合成方法H合成抑制剂IX(实施例130)：

在步骤2中使用铁作为还原剂(实施例130)：

步骤1：将4-甲基哌啶-4-醇(0.24g，1.84mmol)和碳酸钾(0.49g，3.52mmol)加入3-氟-2-硝基苯胺(0.25g，1.60mmol)在MeCN(2.6mL)中的溶液中。将所得混合物在85℃下搅拌10h。在减压下除去MeCN并加入EtOAc。将混悬液离心并倒入烧瓶中。浓缩溶液，粗1-(3-氨基-2-硝基-苯基)-4-甲基-哌啶-4-醇(0.40g，94％产率)用于下一步骤中而无需进一步纯化。MS m/z 252.2(MH

步骤2(使用铁作为还原剂)：将铁(0.37g，6.70mmol)和氯化铵(0.36g，6.7mmol)加入iPrOH(6.5mL)中的1-(3-氨基-2-硝基-苯基)-4-甲基-哌啶-4-醇(0.34g，1.34mmol)和甲酸(1.9mL，49.6mmol)的混合物中。将所得混合物加热至90℃并搅拌10小时。将反应混合物冷却至室温，并通过

步骤3(实施例130)：使用一般方法A所述的程序将来自步骤2的苯并咪唑偶联至中间体I(Ar＝2，3-二氯苯基)。

在步骤2中使用锌作为还原剂(苯并咪唑片段C328的制备)：

步骤1：用(R)-3-甲氧基哌啶盐酸盐代替4-甲基哌啶-4-醇。步骤1的硝基芳烃以88％的产率获得，为红色固体，并在步骤2中直接使用而无需纯化：MS m/z 252.1(MH+)。MSm/z252.1(MH

步骤2：在配有聚四氟乙烯涂层磁力搅拌棒的250mL圆底烧瓶中，在氮气下，用一次性加入的锌粉(2.7g，38.16mmol)处理来自步骤1的粗产物(1.37g，5.45mmol)和氯化铵(4.08g，76.3mmol)在甲醇(18mL)和2-甲基四氢呋喃(36mL)中的混合物。观察到放热，约10分钟后反应混合物变为无色。将反应混合物搅拌1小时，LCMS显示清洁转化为1,2-二氨基苯。将反应混合物通过小硅藻土垫过滤，用DCM:异丙醇(9：1，30mL)洗涤。滤液用DCM异丙醇(9:1，100mL)稀释，并用10％碳酸钾水溶液(30mL，pH～10)洗涤。收集有机相并用无水硫酸镁干燥。在减压下蒸发溶剂，得到1.2g：MS m/z 222.2(MH

将粗1,2-二苯胺环化为所想要的苯并咪唑，如下：在配备有聚四氟乙烯涂层的磁力搅拌棒、回流冷凝器和氮气的100mL圆底烧瓶中加入2-丙醇(20mL)和来自上述的粗产物(1.20g，5.42mmol)。然后，将甲酸(5mL，132mmol)一次性加入，并将所得溶液在60℃下加热16小时。LCMS指示所想要的苯并咪唑(m/z 232)的清洁形成。冷却的反应混合物用DCM:2-丙醇(9:1，200ml)稀释，用10％碳酸钾水溶液(40mL，pH 10)、盐水洗涤，并用无水硫酸镁干燥。在减压下蒸发溶剂得到褐色固体。将该固体在硅胶(3x 12cm)上进行色谱分离，洗脱乙酸乙酯-2-丙醇(90:5至9:1)，得到1.01g(81％产率)。用乙酸乙酯(10mL)进行研磨，得到0.88g浅橙褐色固体：MS m/z 232.1(MH

在表3中的方法H下列出了在步骤1中使用合适的胺和在步骤2中使用铁或锌作为还原剂以类似方式制备的抑制剂的其他实施例。

使用一般合成方法I合成抑制剂X(实施例138)：

步骤1：将1-氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸烷盐酸盐(188mg，1.06mmol)和碳酸钾(2.20当量，292mg，2.11mmol)加入3-氟-2-硝基苯胺(150mg，0.961mmol)在ACN(4.5mL)中的亮红色溶液中。将所得混合物在90℃下搅拌16小时。完成后，用ACN稀释反应混合物并离心。分离上清液，并在下一步骤中按原样使用。MS m/z 278.3(MH

步骤2：向ACN中的2-硝基-3-(1-氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸-8-基)苯胺(250mg，0.901mmol)中加入氯化铵(1028mg，19.2mmol)和锌(628mg，9.61mmol)。将所得混悬液在40℃下搅拌1小时。完成后，用EtOAc稀释反应混合物，然后离心。分离上清液并在真空下蒸发。残留物3-(1-氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸-8-基)苯-1,2-二胺(194mg，0.784mmol，82％产率)按原样用于下一步骤。MS m/z 248.2(MH

步骤3：将3-(1-氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸-8-基)苯-1,2-二胺(194mg，0.78mmol)溶于AcOH(6mL)中，然后加入亚硝酸钠(54mg，0.78mmol)并在室温下搅拌1h。完成后，加入EtOAc和NaHCO

步骤4(实施例138)：使用一般方法A所述程序将来自步骤3的苯并三唑偶联至中间体I(Ar＝2,3-二氯苯基)。

在步骤1中使用合适的胺以类似方式制备的抑制剂的其他实施例在表3中的方法I下列出。

实施例114的制备：

步骤1-4-(吡啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑的制备：将溴苯并咪唑(70mg，0.355mmol)、碳酸钾(196mg，1.42mmol)和3-吡啶硼酸(57mg，0.46mmol)装入4mL小瓶中，并加入二噁烷(2mL)和水(0.7mL)。氩气鼓泡通过混合物1分钟，然后加入四(三苯基膦)钯(0)(16.4mg，0.014mmol)。再次将氩气鼓泡通过溶液3分钟，密封小瓶并在100℃下加热2小时(根据LCMS分析判断，转化为所想要的产物已完成)。将反应混合物冷却至RT，用EtOAc稀释并用盐水洗涤。在MgSO

步骤2：如一般方法A中所述，将硫代甲基衍生物I(Ar＝3-氟-2-甲基苯基；实施例90)氧化成亚砜和砜的混合物。

步骤3(实施例114)：由步骤1中描述的苯并咪唑衍生物和来自步骤2的亚砜/砜混合物使用一般方法A制备。

(R)-3-(二氟甲氧基)吡咯烷盐酸盐的制备：

(R)-N-Boc-3-羟基吡咯烷使用2-氟磺酰基-2,2-二氟乙酸和碘化铜(I)催化进行二氟甲基化，如J.Org.Chem.2016,81,5803所述，随后用二噁烷中的4N HCl去除N-Boc保护基团。

(S)-3-乙基吡咯烷盐酸盐的制备：

步骤1：将可市购得到的(R)-2-(1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基)乙酸(2.0g，8.72mmol)溶于无水THF(25mL)中，并加入1M BH

步骤2：将来自步骤1的(R)叔丁基3-(2-羟乙基)吡咯烷-1-羧酸酯(1.0g，4.64mmol)溶于DCM(15mL)中，并加入三乙胺(1.55mL，11mmol)。将混合物冷却至0℃，并滴加甲磺酰氯(0.58mL，7.4mmol)在DCM(2mL)中的溶液。将反应混合物在0℃下搅拌约1h。然后用DCM(15mL)稀释反应混合物，并用饱和NaHCO

步骤3：将来自步骤2的粗甲磺酸酯(0.60g，2.0mmol)溶于THF(10mL)中，并将溶液在冰水浴中冷却。缓慢加入在THF中的1M三乙基硼氢化锂(4.70mL，4.70mmol)，之后除去冰浴，并将混合物在室温下搅拌2小时。TLC(2:1，乙酸乙酯/己烷)显示没有起始材料。缓慢加入甲醇(5mL)以淬灭反应，并在减压下除去有机溶剂。将粗反应混合物在EtOAc(30mL)和水(15mL)中分配，并用盐水(10mL)洗涤有机层。分离有机层，用无水Na

步骤4：将来自步骤3的羧酸酯(250mg，1.25mmol)溶于MeOH(2mL)中，并加入4M HCl的二噁烷(2mL，8mmol)。将反应物在RT下搅拌2小时。然后在减压下除去挥发物，残余物与乙酸乙酯共沸至干，残余物在真空下干燥，得到稠油状的(S)-3-乙基吡咯烷盐酸盐(162mg，产率95％)。

(R)-3-(甲氧基甲基)吡咯烷盐酸盐的制备：

步骤1：将(R)-叔丁基3-(羟甲基)吡咯烷-1-羧酸酯(1.00g，4.97mmol)溶于THF(20mL)中，并将溶液在冰水浴中冷却。分批加入NaH 60％油分散体(0.60g，14.91mmol)，将反应混合物在0℃下搅拌15分钟。缓慢加入碘甲烷(1.55mL，24mmol)并将反应混合物室温搅拌过夜。然后用饱和NH

步骤2：将来自步骤1的(R)-叔丁基3-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-羧酸酯(100mg，0.46mmol)在DCM(2mL)中与4M HCl在二噁烷(2mL，8.0mmol)中混合，并将混合物在RT下搅拌2小时。在减压下蒸发挥发物，残留物与EtOAc共蒸发至干，产物在真空下干燥，得到(R)-3-(甲氧基甲基)吡咯烷盐酸盐(70mg)，其为油状物，无需进一步纯化即可使用。

实施例89的制备：

步骤1：将2-氯-6-氟苯胺(10g)装入250mL烧瓶中并溶解在40mL冰醋酸中。在室温下添加乙酸酐(7.47mL)并将所得混合物在90℃下搅拌1小时，此时LCMS分析显示反应完成。减压除去挥发物，将残余物溶解在DCM中并用饱和NaHCO

步骤2：将来自步骤1的乙酰苯胺(12.75g)溶于25mL的浓硫酸中，并在冰浴中冷却至0℃。缓慢添加硝酸(90％,3.31mL)。5-10分钟后，混合物变成固体团块。将其升温至室温，产生浓稠的深紫红色泥状沉积物。总共4小时后，通过LCMS监测反应，显示一些剩余的起始材料。另外添加5mL硫酸以改善流动性，然后添加0.3mL的90％硝酸。将混合物在室温下再搅拌18小时。然后将混合物冷却至0℃并倒在碎冰(～150mL)上。一旦冰融化，对混悬液进行超声处理并将黄色固体通过过滤收集，用水洗涤并干燥(15.1g粗产物)。将粗固体溶于50mL乙腈中并使其回流，得到澄清的深红色溶液。停止加热并经1小时将混合物冷却至室温，然后在室温下搅拌2小时。此时混合物已变成固体团块，将其用抹刀打碎并进行超声处理。然后通过过滤收集固体并用少量冷乙腈洗涤。如通过NMR所示，获得呈单一区域异构体的所想要的灰白色硝基化合物(6.63g)(母液产生第二批2.16g，其含有7％的6-氯-2-氟-3-硝基乙酰苯胺)：

步骤3：向来自步骤2的硝基乙酰苯胺(500mg,2.15mmol)于15mL乙醇中的溶液中添加NH

步骤4：使用4-甲氧基苯磺酰氯，以如方案A中A-9所述的通用方式，将来自步骤3的苯胺进行磺酰化：

步骤5：将来自步骤4的乙酰苯胺(200mg,0.54mmol)溶于1.5mL乙醇中，然后缓慢添加浓HCl和水(2mL)的1:1混合物。然后将黄色浆液升温至80℃并搅拌1小时。此时，添加1mL乙醇以提高溶解度。将混合物在相同温度下再搅拌5小时(到那时混合物已变成澄清的黄色溶液)。此时的LCMS分析显示剩余起始材料<3％。将混合物浓缩以除去大部分乙醇，然后在冰上冷却。将其用4N NaOH碱化至pH 5-6。将所得混悬液进行超声处理并通过过滤收集固体并用水洗涤。减压干燥后，得到156mg所想要的产物，呈米色固体：

步骤6：使用由合成中间体A-5制备式I的抑制剂的方案A中描述的方法(步骤1，实施例1)，使来自步骤5的苯胺与中间体A-10反应以提供实施例89。

实施例135的制备：

步骤1：向100mL圆底烧瓶中加入在DMF(15mL)中的2,6-二氟硝基苯(1.3mL，12.6mmol)和氰基乙酸乙酯(1.6mL，15.1mmol)。接下来，在室温下缓慢加入氢化钠(754mg，18.9mmol)。使反应在室温下搅拌15分钟。用1M HCl淬灭反应，直到深红色溶液变黄，然后在EtOAc中稀释。分离有机层，然后用NH

步骤2：将来自步骤1的苯基乙腈衍生物(200mg，1.11mmol)和DMSO(4mL)装入25mL烧瓶中。然后在室温下加入三氟甲磺酸二苯(乙烯基)锍(479mg，1.32mmol)，然后加入1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(0.37ml，2.48mmol)。将该混合物在该温度下搅拌16小时。完成后，加入NH

步骤3：向10mL微波小瓶中加入步骤2的环丙烷衍生物(138mg，0.67mmol)。接下来，向反应物中加入3mL浓氢氧化铵。将反应物在130℃的微波中加热1h。完成后，用水稀释反应，然后用EtOAc萃取。有机层用盐水洗涤，用MgSO

步骤4：中间体1,2-苯二胺还原和闭环为苯并三唑环使用用于实施例138的一般方法I的步骤2和步骤3中描述的程序进行。

步骤5(实施例135)：使用一般方法A所述程序将来自步骤4的苯并三唑偶联至中间体I(Ar＝2,3-二氯苯基)。

实施例137的制备：

步骤1：将碳酸钾(0.35g，2.56mmol)和2-甲氧基乙醇(0.40mL，5.1mmol)加入3-氟-2-硝基苯胺(0.10g，0.641mmol)的DMF(3.2mL)溶液中。将所得混合物在80℃下搅拌10小时。加入水并用EtOAc萃取含水混合物。将有机层合并，用盐水洗涤，用NA

步骤2：中间体1,2-苯二胺还原和闭环为苯并三唑环使用用于实施例138的一般方法I的步骤2和步骤3中描述的程序进行。

步骤3(实施例137)：使用一般方法A中描述的程序将来自步骤2的苯并三唑与中间体I(Ar＝2,3-二氯苯基)偶联。

实施例160至实施例163的制备(表5)：

步骤1：2,4,5-三氟苯胺的碳甲氧基化如专利WO2020/261156中所述进行。

步骤2：在室温下，向3-氨基-2,5,6-三氟苯甲酸甲酯(2.72g，13.26mmol)的DCE/吡啶(1:1，16mL)溶液中逐份加入2,3-二氯苯磺酰氯(3.91g，15.9mmol)。将反应加热至70℃，持续16小时。反应通过LCMS进行监测。当反应完成时，用1M的HCl淬灭。水层用EtOAc(15mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水洗涤，用MgSO

步骤3：在室温下向来自步骤2的3-((2,3-二氯苯基)磺酰胺基)-2,5,6-三氟苯甲酸甲酯(5.14g，12.4mmol)在30mL THF:MeOH(5:1)中的溶液中加入2M KOH(37mL，74.5mmol)。将反应物在室温下搅拌过夜。当反应完成时，将其蒸发至干，并向残留物中加入水(30mL)和二乙醚(30mL)。水层用醚(20mL)洗涤两次。用1M的HCl将水层酸化至pH＝2。水层用EtOAc(30mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水洗涤，用MgSO

步骤4：在室温下，向来自步骤3的3-((2,3-二氯苯基)磺酰胺基)-2,5,6-三氟苯甲酸(4.50g，11.2mmol)在乙腈(30mL)中的溶液中加入三乙胺(1.71mL，12.37mmol)和二苯基磷酰基叠氮化物(2.91mL，13.50mmol)。将反应加热至80℃过夜。将反应冷却至rt，并加入水(30mL)。水层用EtOAc(30mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水洗涤，用MgSO

步骤5：向来自步骤4的2,3-二氯-N-(2,4,5-三氟-3-异氰酸基苯基)苯磺酰胺(1.35g，3.39mmol)在THF(17mL)中的溶液中加入LiOH 4M水溶液(17mL)。将压力容器拧紧，并在油浴中加热至100℃，持续1小时。当反应完成时，用饱和NH

步骤6：如在一般方法A(实施例36)中所述，将步骤5的苯胺转化为嘧啶并嘧啶，其中Ar＝2,6-二氯苯基。

步骤7(实施例160至实施例163，表5)：根据一般方法A中的方案，使用适当取代的苯并咪唑(实施例160、实施例162、实施例163)或苯并三唑(实施例161)，将来自步骤6的硫代甲基中间体转化为抑制剂。

生物活性

体外生物活性

(a)

化合物制备：将1打兰小瓶中的每种物质的固体样品以20mM的储备浓度混悬在DMSO(Fisher Scientific)中。将储液保存在-20℃下并避光。如果20mM的化合物的溶解度表现为有问题，则将DMSO储液的初始浓度更改为10mM或5mM。

体外酶促反应用于评价化合物针对BRAF、CRAF和ARAF的内在活性。对于BRAF和CRAF，将0.375nM纯化的GST-标记激酶(分别来自Millipore Sigma的目录号B4062-10UG和目录号R1656-10UG)与75nM激酶-死亡MEK1底物(目录号40075；BPS Bioscience)在10μM的Ultrapure ATP(目录号V9102；Promega；部分V915A)的存在下，在有和没有测试化合物的情况下在含50mM HEPES pH 7.5、10mM MgCl

对于化合物处理，将5μL/孔的测试物质溶液置于384孔代替板(Perkin Elmer)中，并与2x浓缩激酶反应物混合。选择稀释系列，使九个浓度覆盖从100nM到0.01nM的范围。如有必要(如果化合物表现出低内在效力)，将100nM的初始浓度更改为1μM或0.5μM，并相应地进行进一步稀释。测定中DMSO的终浓度设定为0.05％。

BRAF和CRAF激酶反应在30℃下进行总共2小时，然后通过ADP-Glo试剂(目录号V9102；Promega；部分V912C)中的1/2稀释来停止。然后将反应物在室温下孵育1小时，然后添加一体积的激酶检测试剂(目录号V9102；Promega；部分V917A)。然后将板在室温下平衡30分钟，然后在Synergy Neo2读板仪(Biotek)上检测发光。每种化合物稀释度对BRAF和CRAF激酶活性的影响表示为抑制％并计算如下。首先，从每个数据点中减去内部100％抑制对照(仅包含激酶死亡MEK1底物的激酶反应中的发光平均值)。确定DMSO(媒介物)对照(设置为0％抑制)的平均值并用于计算抑制％：

抑制％＝100*(1-((发光信号

ARAF激酶反应在30℃下进行总共2小时，然后通过添加终浓度为40mM的EDTA终止。然后使用

还确定DMSO(媒介物)对照(设置为0％抑制)的平均值并用于计算抑制％：

抑制％＝100*(1-((pMEK信号

IC

因此，本文报道的所有物质都是BRAF、CRAF和ARAF ATP-竞争性激酶抑制剂，如体外酶促活性的直接抑制所证明的。化合物的BRAF和CRAF抑制效力列于表2至表5中，而代表性类似物的ARAF激酶抑制效力列于表A中。实施方式中定义的优选实施例显示BRAF IC

表A.ARAF激酶抑制结果

对于ARAF生化激酶测定，*表示IC

**表示10nM至20nM的IC

(b)

所有癌细胞系(A375、A101D、A2058、RKO、HT29SK-MEL 30、IPC298、HepG2、HCT-116、Lovo、SW620、SW480、NCI-H358、NCI-H2122、Calu-6、NCIH2087、NCIH1755、NCIH1666和Mewo)从ATCC获得，并在补充有5％热灭活胎牛血清(FBS,Wisent)的RPMI-1640培养基(Gibco)中于37℃、5％ CO

表B.用于本申请中描述的物质的pERK和抗增殖谱分析的癌细胞系(CCL)的肿瘤类型和RAS-ERK途径突变状态。

(c)

Ultra

表C.对于每个癌细胞系，每个孔涂铺的细胞数。

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在稀释系列中，将在完全RPMI-1640生长培养基中制备的100μL/孔测试物质稀释液添加到细胞。选择稀释系列，使十个浓度覆盖从30μM或10μM到0.33nM的范围。如果需要，将初始浓度10μM增加至100μM或降低至1μM(如A375和NCIH1666细胞的情况下，它们通常对化合物更敏感)，并相应地进行进一步稀释。测定中DMSO的终浓度设定为0.5％。

处理后，除去培养基，并在50μL 1X AlphaScreen Ultra Lysis Buffer(PerkinElmer)中裂解细胞。根据制造商的说明书，

每种化合物稀释度对pERK信号的影响以抑制％表示并如下计算。每个板中均包含内部100％抑制对照(1μM曲美替尼，目录号HY-10999；MedChem Express；目录号871700-17-3)，并用作pERK背景的量度。首先，从每个数据点中减去对于曲美替尼获得的值。确定DMSO(媒介物)对照(设置为0％抑制)的平均值并用于计算抑制％：

抑制％＝100*(1-((pERK信号

每种化合物抑制pERK信号的能力表示为IC

当存在时，矛盾的pERK诱导是从化合物的pERK IC

1.最高测试剂量(30μM、10μM或1μM)下的抑制％超过50％。

2.IC

本领域技术人员众所周知，在此类实验中预期抑制值会出现一些变化。±20％的Y

图1显示了在RAS突变型HCT116细胞中不诱导pERK信号传导的矛盾诱导(Y

显著地，根据上述标准，如本文所定义的化合物不诱导该途径的矛盾激活。这种高度期望的特性的进一步说明可以使用如下所述的免疫印迹分析来说明，并且在图2中针对无诱导化合物(实施例80)和诱导剂PLX4720进行了描绘。

为了进行免疫印迹分析，将500000个HCT-116细胞涂铺于24孔平底透明培养皿(Costar)中的1mL完整RPMI-1640生长培养基内。将细胞在37℃、5％ CO

图2显示了用不诱导pERK或pMEK信号传导的矛盾诱导的代表性化合物(实施例80；上图)并且作为比较，在相同细胞系中诱导该途径的化合物(PLX4720；下图)处理的RAS突变的HCT-116细胞的免疫印迹分析结果。还通过免疫印迹探测总MEK和总ERK信号，以确保不同条件下蛋白质样品的加载量相等。以微摩尔为单位的化合物浓度显示在免疫印迹图上方。用于处理的浓度范围与实施例80和PLX4720相同。

实施例化合物1至实施例化合物163在结肠G13D Ras突变的HCT-116细胞系中显示出pERK抑制活性，如表2至表5中所示。此外，一些实施例还显示出在携带KRAS的G12D等位基因的SW480结肠细胞系中pERK信号传导的无矛盾诱导的抑制(表2至表5)。此外，还测试了来自表2至表5中的一些实施例在包含BRAF

还在另外的肿瘤细胞上测试了如本文定义的代表性化合物的pERK抑制活性，并且在携带各种NRAS、KRAS和NF1等位基因并代表多种组织类型(即，SK-MEL 30、IPC298、HepG2、HCT-116、Lovo、SW620、SW480、NCI-H358、NCI-H2122、Calu-6和Mewo；表D，并对于基因型参考表B)的癌细胞系中显示出良好至非常良好的pERK抑制活性。化合物的pERK抑制活性在带有BRAF等位基因(A375、A101D、A2058、RKO、HT29、NCIH2087、NCIH1755和NCIH1666)的癌细胞系中更强(表D)。

表D(D-1和D-2).一组RAS突变的癌细胞系(基因型见表B)和BRAF

D-1.

在pERK中：+表示IC

D-2.

在pERK中：+表示IC

对于RAS突变的癌细胞系，pERK IC

(d)

CellTiter-

表E.96孔板每个孔涂铺的细胞数，以进行CellTiter-

在稀释系列中，将在完全RPMI-1640生长培养基中制备的100μL/孔测试物质稀释液添加到最初涂铺在100μL生长培养基中的细胞。选择稀释系列，使十个浓度覆盖从30μM或10μM到0.33μM的范围。如有必要(如在A375细胞的情况下，其对化合物更敏感)，将10μM的初始浓度降低至1μM，并相应地进行进一步稀释。测定中DMSO的终浓度设定为0.5％。

孵育3天后，通过抽吸除去生长培养基，并向每孔中添加60μL稀释的CellTiter-

每种化合物稀释度对癌细胞系增殖的影响以抑制％表示并如下计算。每个板中均包含内部100％抑制对照(1μM曲美替尼，目录号HY-10999；MedChem Express；目录号871700-17-3)，并用作CellTiter-

抑制％＝100*(1-((CellTiter-

每种化合物抑制增殖的能力表示为EC

如表D所示，活性物质在代表各种组织类型的各种NRAS-、KRAS-和NF1-突变癌细胞系(即，SK-MEL 30、IPC298、HepG2、HCT-116、Lovo、SW620、SW480、NCI-H358、NCI-H2122、Calu-6和Mewo；表D并且对于基因型参考表B)中显示了抗增殖活性。携带BRAF驱动突变的细胞系中的抗增殖活性通常甚至更强(表D)。值得注意的是，pERK降低的IC

(e)

下表2至表5总结了示例性化合物结构、合成方法和生物学结果。这些表中的每一个后面都有各自的表格，总结了化合物的化学特征。

表2

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对于pERK测定，+表示10μM-30μM的IC

表2中化合物的表征

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表3

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对于pERK测定，+表示10μM-30μM的IC

表3中化合物的表征

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表4

对于pERK测定，+表示10μM-30μM的IC

表4中化合物的表征

表5

对于pERK测定，+表示10μM-30μM的IC

表5中化合物的表征

在不脱离本发明的范围的情况下，可以对上述实施方式中的任一个进行多种修改。本文档中提及的任何参考文献、专利或科学文献均出于所有目的通过引用整体并入本文。