艾叶AaYABBY1基因cDNA及其在提高植物黄酮含量中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物技术相关技术领域。更具体地说，本发明涉及一种艾叶AaYABBY1基因cDNA、引物、载体、宿主菌及应用。

背景技术

艾叶为菊科植物艾(Artemisia argyi H.Lév.&Vaniot)的干燥叶，具有温经止血、散寒止痛等功效。艾叶中化学成分主要包括黄酮类、萜类、挥发油、苯丙素类等。黄酮类成分是艾叶中一类主要成分，现已从艾叶中鉴定出50余种黄酮类成分，其具有抗炎、抗肿瘤等多种药理作用。

药用植物关键活性成分是药材发挥药理作用的重要物质基础和质量评价指标，其可在植物的根、茎、叶等不同器官内合成并积累。黄酮是艾叶中一类主要成分，也是艾叶发挥药理作用的重要物质基础。艾叶黄酮类成分具有抗炎、抗肿瘤等多种作用。例如艾叶总黄酮能够抑制肝癌细胞增殖，并可通过多个蛋白诱导其凋亡。艾叶中异泽兰黄素能够抑制神经胶质瘤细胞的活力和增殖；还能够诱导肝癌细胞的凋亡，其相关药理作用机制也被阐释。此外，艾叶黄酮成分还能够通过调节巨噬细胞促炎性细胞因子水平，从而发挥一定抗炎作用。

YABBY家族转录因子是具有锌指结构和螺旋-环-螺旋结构的转录因子，是一类小的转录因子家族，目前仅在种子植物中发现，该类转录因子能够调控植物叶、花发育和侧生器官细胞分化等。例如模式植物拟南芥的YABBY基因参与花器官和叶的发育。水稻OsYABBY6基因参与其叶的发育调控；辣椒YABBY基因家族成员广泛表达于叶和花；番茄YABBY家族基因参与其根、茎、叶、花、蜜腺、心皮、胚珠等器官的调控。如果能够利用YABBY基因提升黄酮含量，可预期有较高的医药价值和经济价值。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种艾叶AaYABBY1基因cDNA、引物、载体、宿主菌及应用，为提升植物黄酮含量提供基础。

为了实现本发明的这些目的和其它优点，根据本发明的一个方面，本发明提供了艾叶AaYABBY1基因cDNA，所述艾叶AaYABBY1基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了艾叶AaYABBY1基因cDNA的同源基因，与所述艾叶AaYABBY1基因cDNA同源。

本发明还提供了扩增所述艾叶AaYABBY1基因cDNA的引物。

本发明还提供了含有所述艾叶AaYABBY1基因cDNA的重组载体。

本发明还提供了含有所述重组载体的宿主菌。

本发明还提供了艾叶AaYABBY1基因cDNA的应用，培育具有高黄酮含量的植物。

进一步地，所述植物为烟草或艾。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明克隆出艾叶AaYABBY1基因，通过构建过表达载体遗传转化到植物中，能够显著提高所得转基因植物中总黄酮的含量，同时使黄酮合成途径上的CHS、CHI、F3H、FLS和F3’H基因表达显著上调，可广泛应用于提高植物中黄酮的含量，对培育艾新种质资源具有很好的应用前景。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明分段克隆的艾叶AaYABBY1基因的电泳图；

图2为本发明克隆的艾叶AaYABBY1基因的系统进化树分析图；

图3为本发明克隆的艾叶AaYABBY1基因的亚细胞定位图；

图4为本发明克隆的艾叶AaYABBY1基因在艾叶不同器官中的表达水平图，从左至右分别为叶、茎、根；

图5为本发明克隆的艾叶AaYABBY1基因转基因至烟草K326后PCR的检测电泳图；

图6为本发明克隆的艾叶AaYABBY1基因转基因至烟草K326后AaYABBY1基因的表达水平分析图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本申请的实施例提供了艾叶AaYABBY1基因cDNA，所述艾叶AaYABBY1基因cD NA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：ATAATGCCTTTGCCTCTTAGCTCTT TGGATCCTATCCCATTTCCCTTCTTTACAATTTCCACCTTCAGATTTATAACATCATATATCTACAAATGTTTTTTCATCTATAAATAGAAACCACTTGAAACAATAAAACACTGTAGTGATCACCACAACTTCAAACACACACAAACAAACACAAAAAGAGTTGAGAGTTACTTCGATTTATAGAAAGAGACTAACTTGCTTGGATCATCAAAAGAGAGATGTCAAGCATAGATGTAGCAGCATCATCTGAGCAATTGTGTTATATCCCTTGTAACTTTTGCAATATTGTTCTTGCGGTGAGTGTACCATGCAACAGCTTGTTTGACATAGTGACAGTAAGATGTGGACACTGCACCAATTTGTGGTCTGTGAATATGGGCATGGCTGCTGCCTTTCATCAGTCTCTCTCAAATTCCAATTCCACCTCCCAAGATTCAACTGCTCCTCACCATCCTCAGAAGGCTCCAACCCACACTCCTCCAAATTATAGGGTTGATTTGGGCTCATCTTCAAAGTACAACAGTCGAATGCCGTCGTCCCCAGTCTCCATCACAAGTGACCCGAAGATCAATCGCCCCCCAGAGAAAAGACAACGGGTTCCTTCAGCGTATAACCAGTTCATAAAGGAGGAGATCCAAAGGATCAAGGCAAATAATCCAGATATCAGCCATAGGGAAGCTTTTAGTACGGCTGCAAAAAATTGGGCACATTTTCCTCACATTCATTTTGGATTGATGTTGGACGCAAATAACCACCAAGCTAAACTTGATGAGCTGAGTTGTGTGCAGGGATCCGAGAAACGACACAGATCAAGGACCTCATTATTCAAGAAATGATTAAAGCTTGATCATAAGAAGAAATTAAAGCAAAATCCTCTTATATATTTATATATATTTTGAGTTCAAGAAGACCGTGGCCTTAACTTGTTTTTAAGGATAAAAACGAATATTTGGATATTTTTAAGTTGCAATTTACAGTCACATGAGTGATTTTATTTGTGGTTTGATTTGTTTCCCAGAACTAAGCTAGTTGGCTTGCCTATAAATAAATCGATCGCGTGCAAATTAACATGACCACTGTAAAAGTACTCATATATCAAATGACTCAATGTTATCTCATG。

本申请的实施例还提供了艾叶AaYABBY1基因cDNA的同源基因，与所述艾叶AaYABBY1基因cDNA同源，并且能够替代艾叶AaYABBY1基因cDNA。

本申请的实施例还提供了扩增所述艾叶AaYABBY1基因cDNA的引物，用于实现艾叶AaYABBY1基因cDNA的克隆。

本申请的实施例还提供了含有所述艾叶AaYABBY1基因cDNA的重组载体，用于实现将艾叶AaYABBY1基因cDNA转入宿主菌。

本申请的实施例还提供了含有所述重组载体的宿主菌，例如可以使用农杆菌，用于实现将艾叶AaYABBY1基因cDNA转入植物细胞。

本申请的实施例还提供了艾叶AaYABBY1基因cDNA的应用，将艾叶AaYABBY1基因cDNA转入转入植物细胞后进行育种，培育具有高黄酮含量的植物；优选地，所述植物为烟草或艾。

以下以具体实施例说明。

<实施例1>提供了克隆艾叶AaYABBY1基因的cDNA序列SEQ ID NO.1的方法，还提供了扩增引物。

艾叶AaYABBY1基因的cDNA序列的获得包括以下步骤：

步骤一、RNA提取：采用RNA抽提试剂盒从艾的新鲜幼叶中提取总RNA，并用RNaseFree DNase(Promega，美国)进行预处理消除基因组DNA污染。用1.5％琼脂糖凝胶分析RNA完整性，用分光光度法测定RNA的纯度和浓度。

步骤二、第一链cDNA合成：在0.2mL PCR管中加入以下试剂：5μL Total RNA、1μLRandom Primer p(dN)

步骤三、基因分段克隆：使用LA Taq(TaKaRa，DRR02AG)试剂在PCR仪(Eppendorf，德国)上进行检测。用Primer 5.0软件设计并合成基因特异性引物，

F:ATAATGCCTTTGCCTCTTAGCTC(SEQ ID NO.2)

R:CTTGATCCTTTGGATCTCCTC(SEQ ID NO.3)

F:GAGGAGATCCAAAGGATCAAG(SEQ ID NO.4)

R:CATGAGATAACATTGAGTCATTTGATATATGAG(SEQ ID NO.5)

PCR扩增程序为：94℃5min；94℃30s，55℃45s，72℃90s，30个循环；72℃10min。

步骤四、PCR电泳与回收：将PCR产物跑1％的TAE琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，将目的片段用柱式DNA胶回收试剂盒(Axygen，AP-GX-50)进行回收，然后将回收片段测序，获得SEQ ID NO.1序列。

<实施例2>艾叶YABBY转录因子AaYABBY1基因核苷酸序列的系统进化树进行分析，并提供了AaYABBY1基因cDNA的一种同源基因。

艾叶YABBY转录因子AaYABBY1基因SEQ ID NO.1序列包含1050个核苷酸，将序列在NCBI上进行同源性检索，通过MEGA 5.0软件进行系统进化树分析，方法采用Neighbor-Joinjing，bootstrap统计检验，次数设置为1000。发现该基因与其它物种YABBY基因有较高的同源性，其中与黄花蒿AaYABBY5亲缘关系最近，同源性达到96.76％，结果如图2所示。

<实施例3>对艾叶YABBY转录因子AaYABBY1基因进行亚细胞定位，并提供了AaYABBY1基因cDNA的载体、宿主菌。

利用实施例1方法获得的AaYABBY1基因序列，通过对pC131-YFP载体多克隆位点和AaYABBY1基因序列的酶切位点进行分析，引物两端添加EcoRI和SpeI酶切位点。用EcoRI和SpeI分别对目的片段和载体进行双酶切，采用同源重组的方法将目的基因AaYABBY1连接到pC131-YFP载体上，获得融合载体质粒，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用Primer 5.0软件设计并合成PCR扩增引物序列，

F:ATGTCAAGCATAGATGTAGCAGCATCATCTG(SEQ ID NO.6)

R:TTTCTTGAATAATGAGGTCCTTGATCTGTGTCG(SEQ ID NO.7)

通过PCR扩增和酶切筛选阳性克隆进行测序验证，测序结果显示目的基因已与载体融合，且序列完全正确后，将融合载体质粒采用液氮冻融方法转入农杆菌GV3130感受态细胞中，经菌落PCR鉴定无误后，采用农杆菌介导瞬时转化法转化烟草K326叶片。培养过夜的农杆菌离心悬浮，悬浮液组成(10mM MgCl

<实施例4>艾叶YABBY转录因子AaYABBY1基因在艾的不同器官中的表达差异情况进行分析。

步骤一、材料准备：采集新鲜艾的根、茎、叶样品，将样品用自封袋包好，液氮速冻后，于-80℃超低温冰箱中储存。

步骤二、RNA提取：采用RNA抽提试剂盒从艾的根、茎、叶中提取总RNA，并用RNaseFree DNase(Promega，美国)进行预处理消除基因组DNA污染。用1.5％琼脂糖凝胶分析RNA完整性，分光光度法测定RNA含量。

步骤三、cDNA制备：采用AMV第一链cDNA合成试剂盒(Roche，瑞士)合成cDNA。

步骤四、引物设计：选择18S为内源参考基因，利用Primer 5.0软件设计用于qRT-PCR的特异性引物：

AaYABBY1-F：TTGTGGTCTGTGAATATGGGCATGG(SEQ ID NO.8)

AaYABBY1-R：GAGGATGGTGAGGAGCAGTTGAATC(SEQ ID NO.9)

18S-F：GCTGTGCAATGCTGACAAGTCTTC(SEQ ID NO.10)

18S-R：ACCCAGTATCAACTCCCGCTGAG(SEQ ID NO.11)。

步骤五、qRT-PCR：使用2×SG Fast qPCR Master Mix(High Rox,B639273，BBI)定量PCR试剂在StepOne Plus型荧光定量PCR仪(ABI，美国)上进行检测。扩增程序为：95℃30s；95℃5s，60℃30s，45个循环；从65℃至95℃第5秒以0.5℃的间隔收集一次数据。

步骤六、采用2

<实施例5>艾叶YABBY转录因子AaYABBY1基因功能研究和应用。

一、转化烟草K326

(一)转化至烟草K326

将实施例3中的融合载体质粒采用液氮冻融方法转入农杆菌菌株GV3130中，并做菌落PCR检测。采用烟草K326叶片切割为约1×1cm的小块，将叶块正面向下放置在MS预培养基上，预培养2d后放入含有表达载体的农杆菌悬浮液中浸泡5～10min，无菌纸吸干多余菌液，叶块正面朝下接种到MS固体培养基，暗培养2d。

将共培养后的烟草叶块移至MS筛选培养基，每隔15d更换一次培养基，至有绿色芽生成。待芽长至2cm左右时转移至MS生根培养基上进行生根诱导。幼苗长至5～7cm时炼苗出土，提取叶片DNA进行PCR鉴定，筛选阳性植株即为转基因烟草，结果共获得AaYABBY1阳性植株13株，结果如图5所示。利用Primer 5.0软件设计用于PCR的特异性引物：

AaYABBY1-F：AAGTACAACAGTCGAATGCC(SEQ ID NO.12)

AaYABBY1-R：CCTCGCCCTTCACGATAC(SEQ ID NO.13)

利用实施例4中的引物SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9进行qRT-PCR扩增，用熔解曲线法分析目标基因的特异性扩增，选择18S为内源参考基因，用2

二、转基因植物代谢产物分析

采用酶标法，使用植物类黄酮(Flavonoid)测定试剂盒(苏州梦犀生物医药科技有限公司)测定转基因烟草K326叶片中总黄酮的含量。结果表明，转基因烟草K326中的总黄酮含量比对照增加了54.11％。说明AaYABBY1基因对植物黄酮生物合成具有重要作用。

三、AaYABBY1基因过表达调控植物黄酮合成通路基因表达

使用实施例4中的方法对黄酮生物合物通路中的基因表达量进行分析，发现AaYABBY1转基因烟草K326叶片中，所有检测基因表达均上调，除CHI和F3H外，PAL、C4H、4CL、CHS、FLS和F3’H表达量均显著高于对照，分别是对照的4.62倍、4.46倍、2.33倍、18.78倍、11.89倍、3.95倍。

这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明艾叶AaYABBY1基因cDNA及其在提高植物黄酮含量中的应用的修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。