一种GC-MS和GC-IMS联用的测定红毛丹籽油特征香气成分的方法

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，具体为一种GC-MS和GC-IMS联用的测定红毛丹籽油特征香气成分的方法。

背景技术

红毛丹是一种无患子科植物，它的种子含有相对较高的脂肪含量。红毛丹籽油，是从红毛丹籽中提取的天然食用植物油脂。风味是食品的关键特征之一，对食品的感官质量有着决定性的作用，其中香气最为重要，极大地影响了食品的风味特征。油脂风味的产生是来源于其挥发物，而风味的品质特性则与油脂的脂肪酸的组成密切相关。由于红毛丹籽和脂肪中存在挥发性化合物所以会产生香气，而红毛丹籽油的香气特征恰恰是影响其质量的最关键特性之一。

关于油脂香气成分的检测方法主要是使用传统的GC-MS技术，优秀的定性能力、分辨率、定量准确性使得GC-MS技术颇受欢迎，然而，GC-MS法也存在前处理简单、检测灵敏度不高和容易漏检小分子化合物等局限性，气相色谱-离子迁移谱（GC-IMS）解决了传统GC-MS技术中的一些限制，可对不同品种样品进行较好分类，能够对气态离子进行痕量分析，具有检出限低、灵敏度高、分析时间短等优势，但GC-IMS谱库数据量有限，且对大分子化合物的检测能力较低。

为此，我们提出一种GC-MS和GC-IMS联用的测定红毛丹籽油特征香气成分的方法。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明提供如下技术方案：一种GC-MS和GC-IMS联用的测定红毛丹籽油特征香气成分的方法，包括以下步骤：

S100：总脂质提取

首先将红毛丹进行解构，其次通过甲基叔丁基醚-甲醇溶剂体系提取红毛丹籽油，并密封储存；

S200：色谱条件；

S300：质谱条件；

S400：定量分析

分别采用GC-MS和GC-IMS对红毛丹籽油进行特征性香气成分测定。

优选的，所述步骤S100中总脂质提取的具体步骤为：

S110：首先准确称取100 mg样品至5 mL离心管中；

S120：向离心管中加入800 μL蒸馏水和1920 μL MTBE-甲醇溶液（5:1，v/v）；

S130：涡流1 min后，将样品置于冰水浴中超声5 min，重复涡流-超声操作3次；

S140：混合物在-40℃下静置60 min后，于300 rpm下离心15 min，最后收集上清液，氮气吹干得到总脂；

S150：将回收的脂质称重以确定总脂得率，密封，并储藏在-20℃的冰箱直到后续分析。

优选的，所述步骤S200中的色谱条件以及步骤S300中的质谱条件依据使用的仪器以及步骤S100中获得的红毛丹籽油特性进行设定。

优选的，所述步骤S400中定量分析的具体步骤为：

S410：GC-MS分析

用HS-SPME-GC-MS分析红毛丹籽油样品的特征香气成分；

S420：GC-IMS分析

通过Agilent 8090气相色谱系统，配备G.A.S.离子迁移谱仪和PALRSL85顶空自动进样器实现基于HS-GC-IMS的特征香气成分分析。

优选的，所述步骤S410的具体步骤为：

S411：将3 g油样放入10 mL的顶空瓶中，其中插入DVB/CAR/PDMS 50/30 μm 2cm纤维；

S412：样品平衡5 min，在50℃下提取50 min，萃取震摇速度250 rpm；

S413：采用Agilent 6890A/5973C气相色谱-质谱联用系统，配备DB-WAX毛细管柱（30 m×0.25 mm, 0.25 μm），分离鉴定挥发性化合物；

S414：以正构烷烃（C5-C23）为外参，计算保留指数（Ris）；挥发性化合物的定性通过比较来自NIST 20.L数据库的质谱信息和RIs来实现；最后，选择与质谱和RI值最接近的化学结构作为最佳鉴定结果；采用峰面积归一化法对挥发性化合物进行定量（相对含量）分析。

优选的，所述步骤S411中顶空瓶的瓶盖含有硅树脂/聚四氟乙烯隔膜。

优选的，所述步骤S413中使用气相色谱-质谱联用系统分离鉴定挥发性化合物时烘箱温度程序设置为：初始温度在40℃保持1 min，然后以3℃/min的速度升至120℃保持5min，再以5℃/min的速度升至250℃，最后在250℃保持5 min。进样口温度和流速分别为250℃和1 mL/min；所述步骤S413中使用气相色谱-质谱联用系统分离鉴定挥发性化合物时质谱参数设置为：EI电离模式，离子源温度为250℃，电离能为70 eV，传输线温度为240℃，离子质量扫描范围为40～600 m/z。

优选的，所述步骤S420的具体步骤为：

S421：准确称取3 g油样，装入10 mL顶空瓶中，于60℃恒温孵育10 min；

S422：然后，顶空针（80℃）吸取300 μL的顶空气体；

S423：仪器配备的色谱柱为一根型号为HP-5的毛细管柱，且柱流量为1 mL/min，载气为氮气，通过仪器进行测定；

S424：通过将挥发性化合物的RIs和漂移时间与GC-IMS检索库中的标准物进行比较，定性地确定了挥发性化合物，结果以相对丰度表示。

优选的，所述步骤S423中气相色谱系统测定时气相色谱的升温程序设置如下：初始温度为50℃，保持1 min，然后以5℃/min的速度升至130℃，最后以10℃/min的速度升至180℃，保持8 min。

优选的，所述步骤S423中G.A.S.离子迁移谱仪使用时离子迁移谱条件：漂移管长度为10 cm；管内线性电压为350 v/cm；漂移管温度为45℃，漂移气（高纯氮气，纯度≥99.999%)；流速为150mL/min；IMS探测器温度为45℃。

有益效果

与现有技术相比，本发明提供了一种GC-MS和GC-IMS联用的测定红毛丹籽油特征香气成分的方法，具备以下有益效果：

1、该一种GC-MS和GC-IMS联用的测定红毛丹籽油特征香气成分的方法，本发明的方法的建立，填补了测定红毛丹籽油香气成分的空白，通过GC-MS和GC-IMS联用提高了检测灵敏度，为红毛丹籽油香气成分测定提供了新的技术选择。

2、该一种GC-MS和GC-IMS联用的测定红毛丹籽油特征香气成分的方法，通过建立GC-MS联用GC-IMS技术测定红毛丹籽油中特征香气成分的定性定量分析方法，该方法灵敏度高，回收率高，重复性好，可用于红毛丹籽油中特征香气成分的检测，为红毛丹加工研究提供了新的思路和技术支持。

附图说明

图1为本发明的方案技术设计图；

图2为本发明基于HS-SPME-GC-MS对样品分析后挥发性有机化合物的，（A）种类；（B, C D）数量；（E）Venn图；（F）含量热图；（G）峰值强度图；

图3为本发明红毛丹籽油香气成分的多元统计分析结果，（A）PCA 3D得分图；（B）PCA 3D载荷图；（C）Biplot图；（D）层次聚类树状图；（E）OPLS-DA 3D得分图；（F）OPLS-DA 200次交叉验证图；

图4为本发明基于两两比较分析后的多元统计分析结果，（A, E, I）OPLS-DA得分图；（B, F, J）OPLS-DA 200次交叉验证；（C, G, K）S-plots图；（D, H, L）VIP 得分图；

图5为本发明不同组别香气物质含量差异的动态分布图（A, C, E）和火山图（B,D, F）；

图6为本发明整合了筛选标准后，（D, E, F）差异挥发性物质热图；（G, H, I）差异挥发性物质比例；（J）Venn图；（K）差异挥发性物质的含量变化热图；

图7为本发明不同品种红毛丹籽油的挥发性有机物的3D地形图（A）；3D地形俯视图（B）；差异对比图（C）；

图8为本发明不同品种红毛丹籽油挥发性有机物的指纹图谱；

图9为本发明挥发性物质的定性分析；

图10为本发明红毛丹籽油中挥发性化合物数量（A）、比例（B）、簇状热图（C）；差异代谢物热图（D）柱状图（E）；

图11为本发明红毛丹籽油香气成分的多元统计分析结果，（A）PCA 3D得分图；（B）PCA 3D载荷图；（C）Biplot图；（D）层次聚类树状图；（E）OPLS-DA 3D得分图；（F）OPLS-DA 200次交叉验证；

图12为本发明基于成对比较后的多元统计分析结果，（A, D, G）OPLS-DA得分图；（B, E H）S-plots图；（C, F, I）OPLS-DA 200次交叉验证图；

图13为本发明的差异挥发性化合物的动态分布图(A, C, E)和火山图（B, D, F）；

图14为本发明整合筛选标准后，（A, D, G）Venn图；（B, E, H）差异挥发性化合物热图；（C, F, I）差异挥发性化合物比例图；

图15为本发明的（A）差异挥发性化合物的Venn图；（B）差异挥发性物质含量变化热图；（C）差异挥发性物质数量及比例图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1至图5，一种GC-MS和GC-IMS联用的测定红毛丹籽油特征香气成分的方法，包括以下步骤：

S100：总脂质提取

首先将红毛丹进行解构，其次通过甲基叔丁基醚-甲醇溶剂体系提取红毛丹籽油，并密封储存；

S200：色谱条件；

S300：质谱条件；

S400：定量分析

分别采用GC-MS和GC-IMS对红毛丹籽油进行特征性香气成分测定。

作为本发明的一种实施方式，步骤S100中总脂质提取的具体步骤为：

S110：首先准确称取100 mg样品至5 mL离心管中；

S120：向离心管中加入800 μL蒸馏水和1920 μL MTBE-甲醇溶液（5:1，v/v）；

S130：涡流1 min后，将样品置于冰水浴中超声5 min，重复涡流-超声操作3次；

S140：混合物在-40℃下静置60 min后，于300 rpm下离心15 min，最后收集上清液，氮气吹干得到总脂；

S150：将回收的脂质称重以确定总脂得率，密封，并储藏在-20℃的冰箱直到后续分析。

作为本发明的一种实施方式，步骤S200中的色谱条件以及步骤S300中的质谱条件依据使用的仪器以及步骤S100中获得的红毛丹籽油特性进行设定。

作为本发明的一种实施方式，步骤S400中定量分析的具体步骤为：

S410：GC-MS分析

用HS-SPME-GC-MS分析红毛丹籽油样品的特征香气成分；

S420：GC-IMS分析

通过Agilent 8090气相色谱系统，配备G.A.S.离子迁移谱仪和PALRSL85顶空自动进样器实现基于HS-GC-IMS的特征香气成分分析。

作为本发明的一种实施方式，步骤S410的具体步骤为：

S411：将3 g油样放入10 mL的顶空瓶中，其中插入DVB/CAR/PDMS 50/30 μm 2cm纤维；

S412：样品平衡5 min，在50℃下提取50 min，萃取震摇速度250 rpm；

S413：采用Agilent 6890A/5973C气相色谱-质谱联用系统，配备DB-WAX毛细管柱（30 m×0.25 mm, 0.25 μm），分离鉴定挥发性化合物；

S414：以正构烷烃（C5-C23）为外参，计算保留指数（Ris）；挥发性化合物的定性通过比较来自NIST 20.L数据库的质谱信息和RIs来实现；最后，选择与质谱和RI值最接近的化学结构作为最佳鉴定结果；采用峰面积归一化法对挥发性化合物进行定量（相对含量）分析。

作为本发明的一种实施方式，步骤S411中顶空瓶的瓶盖含有硅树脂/聚四氟乙烯隔膜。

作为本发明的一种实施方式，步骤S413中使用气相色谱-质谱联用系统分离鉴定挥发性化合物时烘箱温度程序设置为：初始温度在40℃保持1 min，然后以3℃/min的速度升至120℃保持5 min，再以5℃/min的速度升至250℃，最后在250℃保持5 min。进样口温度和流速分别为250℃和1 mL/min；步骤S413中使用气相色谱-质谱联用系统分离鉴定挥发性化合物时质谱参数设置为：EI电离模式，离子源温度为250℃，电离能为70 eV，传输线温度为240℃，离子质量扫描范围为40～600 m/z。

作为本发明的一种实施方式，步骤S420的具体步骤为：

S421：准确称取3 g油样，装入10 mL顶空瓶中，于60℃恒温孵育10 min；

S422：然后，顶空针（80℃）吸取300 μL的顶空气体；

S423：仪器配备的色谱柱为一根型号为HP-5的毛细管柱，且柱流量为1 mL/min，载气为氮气，通过仪器进行测定；

S424：通过将挥发性化合物的RIs和漂移时间与GC-IMS检索库中的标准物进行比较，定性地确定了挥发性化合物，结果以相对丰度表示。

作为本发明的一种实施方式，步骤S423中气相色谱系统测定时气相色谱的升温程序设置如下：初始温度为50℃，保持1 min，然后以5℃/min的速度升至130℃，最后以10℃/min的速度升至180℃，保持8 min。

作为本发明的一种实施方式，步骤S423中G.A.S.离子迁移谱仪使用时离子迁移谱条件：漂移管长度为10 cm；管内线性电压为350 v/cm；漂移管温度为45℃，漂移气（高纯氮气，纯度≥ 99.999%)；流速为150mL/min；IMS探测器温度为45℃。

实施例：一种GC-MS和GC-IMS联用的测定红毛丹籽油特征香气成分的方法，首先将红毛丹进行解构，其次通过甲基叔丁基醚-甲醇溶剂体系提取红毛丹籽油，最后分别采用GC-MS和GC-IMS对红毛丹籽油进行特征性香气成分测定。

一、技术方案

具体步骤如下：

（1）总脂质提取

共选取三个品种的红毛丹进行实验，三种红毛丹品种分别为保研4号（BR-4）、保研5号（BR-5）以及保研7号（BR-7），首先分别准确称取100 mg样品至5 mL离心管中。接着加入800 μL蒸馏水和1920 μL MTBE-甲醇溶液（5:1，v/v）。涡流1 min后，将样品置于冰水浴中超声5 min。重复涡流-超声操作3次。混合物在-40℃下静置60 min后，于300 rpm下离心15min。最后收集上清液，氮气吹干得到总脂。将回收的脂质称重以确定总脂得率，密封，并储藏在-20℃的冰箱直到后续分析。

（2）GC-MS分析

采用HS-SPME-GC-MS分析红毛丹籽油样品的特征香气成分。将3 g油样放入10 mL的顶空瓶中，瓶盖含有硅树脂/聚四氟乙烯隔膜，其中插入DVB/CAR/PDMS 50/30 μm 2cm纤维。样品平衡5 min，在50℃下提取50 min。萃取震摇速度250 rpm。

采用Agilent 6890A/5973C气相色谱-质谱联用系统，配备DB-WAX毛细管柱（30 m×0.25 mm, 0.25 μm），分离鉴定挥发性化合物。烘箱温度程序设置为：初始温度在40℃保持1 min，然后以3℃/min的速度升至120℃保持5 min，再以5℃/min的速度升至250℃，最后在250℃保持5 min。进样口温度和流速分别为250℃和1 mL/min。质谱参数设置为：EI电离模式，离子源温度为250℃，电离能为70 eV，传输线温度为240℃，离子质量扫描范围为40~600 m/z。

以正构烷烃（C5-C23）为外参，计算保留指数（Ris）。挥发性化合物的定性通过比较来自NIST 20.L数据库的质谱信息和RIs来实现。最后，选择与质谱和RI值最接近的化学结构作为最佳鉴定结果。采用峰面积归一化法对挥发性化合物进行定量（相对含量）分析。

（3）GC-IMS分析

基于HS-GC-IMS的特征香气成分分析通过Agilent 8090气相色谱系统，配备G.A.S.离子迁移谱仪和PALRSL85顶空自动进样器实现。

准确称取3 g油样，装入10 mL顶空瓶中，于60℃恒温孵育10 min。然后，顶空针（80℃）吸取300 μL的顶空气体。仪器配备的色谱柱为一根型号为HP-5的毛细管柱（30 m×0.32mm，膜厚0.25 μm，安捷伦，美国），且柱流量为1 mL/min。载气为氮气（99.999%纯度）。气相色谱的升温程序设置如下：初始温度为50℃，保持1 min，然后以5℃/min的速度升至130℃，最后以10℃/min的速度升至180℃，保持8 min。离子迁移谱条件：漂移管长度为10 cm；管内线性电压为350 v/cm；漂移管温度为45℃，漂移气（高纯氮气，纯度≥ 99.999%)；流速为150mL/min；IMS探测器温度为45℃。通过将挥发性化合物的RIs和漂移时间与GC-IMS检索库（G.A.S.，多特蒙德，德国）中的标准物进行比较，定性地确定了挥发性化合物。结果以相对丰度表示。

利用仪器配套的分析软件（VOCal）和插件（Reporter, Gallery Plot）分别从不同角度对红毛丹籽油的香气成分进行分析。使用Reporter插件直接比较样品之间的光谱差异（二维顶视图、三维光谱和差谱）。使用Gallery Plot插件直观比较指纹图谱，且比较不同样品间挥发性有机化合物的差异。

二、技术效果

2.1 基于HS-SPME-GC-MS的红毛丹籽油特征香气成分分析

2.1.1 红毛丹籽油香气轮廓

采用HS-SPME-GC-MS对样品中的挥发性有机化合物进行了表征。总共135种挥发性化合物在红毛丹籽油中被鉴定出，包括28种碳氢化合物、22种酯类、17种苯类、11种醇类、11种酮类、8种酸类、7种醛类、7种胺类、7种呋喃、6种其他物质、5种萘类、2种吡嗪类、2种硫化合物、1种吡啶类和1种吡咯类（图2A）。整体上来看，碳氢化合物（20.74%）、酯类（16.30%）、苯类（12.59%）和醇类（8.15%）是主要的挥发性物质。

2.1.2 红毛丹籽油香气成分的差异

如图2B, C, D所示，三种红毛丹籽油中所鉴定出的挥发性有机物的数量具有明显不同。最大的挥发性物质数量在BR-5中（63种）被鉴定出，而最少的数量在BR-4中（48种）被观察到。此外，不同类型化合物的数量在不同样本间也存在差异。碳氢化合物是BR-4中最主要的挥发性成分，而酯类是BR-5和BR-7中最主要的成分。这表明本研究分析的三种红毛丹籽油的香气特征不同。Venn图（图2E）对这些挥发性化合物在样品之间的重叠情况进行了可视化，总共7种挥发性化合物（包括对二甲苯、苯，1-乙基-3,5-二甲基-、苯，1-乙基-2,4-二甲基-、苯，1,2,3,5-四甲基-、邻苯二甲酸，4-氟-2-硝基苯基甲基酯、乙酸仲丁酯和萘）被三种红毛丹籽油所共享。34种、43种和33种脂质分子分别仅在BR-4，BR-5，和BR-7中观察到。戊烷，2,3-二甲基-和萘，1,2,3,4-四氢-6-甲基-在BR-4和BR-5中被检出。2-甲基庚酸、乙醇、苯、十二烷酸、甲酯和草酸、丁基环丁酯同时在BR-4和BR-7中被检出。11种挥发性物质在BR-5和BR-7中被同时发现。红毛丹籽油中出现的不同挥发性化合物可能归因于红毛丹品种和环境条件的差异。

为了进一步探讨不同红毛丹籽油中香气物质含量的变化，对每种香气分子进行了归类，并对每个类别的所有香气分子的峰值强度进行求和以表示其相对含量，如图2F和图2G所示。

对于酯类化合物，在本研究中，BR-7中酯类化合物的含量显著高于BR-4和BR-5（图2G）。L-脯氨酸、5-氧代-、正丙酯、丙酸和乙烯基酯是BR-4中最主要的酯类，且未在BR-5和BR-7中被检出。而乙酸仲丁酯和3-甲基丁酸戊酯是BR-5和BR-7中最丰富的酯类。

对于碳氢化合物，如图2G所示，这类香气物质在BR-5中的含量要显著高于其它样本。在BR-4中，只有四种烃分子被鉴定出，包括氮杂环丁烷、1,2-二甲基-，(3E,7E)-4,8,12-三甲基十三-1,3,7,11-四烯、2,3-二甲基-戊烷和2,6-二甲基-壬烷。1,3-己二烯-5-炔和1H-茚，2,3-二氢-5-甲基-是BR-5中最主要的烃类，并且前者在其它油样中未被检出。在BR-7中，3,8-二甲基-十一烷、4,6-二甲基-十一烷和2,3,6-三甲基-辛烷是最丰富的烃类。由于其独特的气味，3,8-二甲基-十一烷已被用作香料的成分。除了品种的影响外，前处理方法也会影响红毛丹籽油中碳氢化合物的水平。

对于酮类化合物，分析结果表明，三种红毛丹籽油中含有不同的酮类化合物。最高的酮类化合物含量在BR-7中发现，而最低的在BR-4中发现（P < 0.05）（图2G）。2-咪唑啉酮、3-庚酮、2-甲基-和5-(环己基甲基)- 2-吡咯烷酮分别是BR-4、BR-5和BR-7中最主要的酮类化合物。

对于醇类化合物，BR-5中的含量要显著高于BR-4和BR-7（图2G）。乙醇是BR-4和BR-7中最丰度的醇类化合物，而2-辛醇和苯乙醇是BR-5中最重要的组分。

对于呋喃，总共7种呋喃在红毛丹籽油中被鉴定出。3,4-二乙酰呋喃、2-乙基四氢呋喃、2-丁基-3-(4-.β.-二乙氨基乙氧基苯甲酰基)苯并呋喃是BR-4中主要的呋喃化合物，5-甲基-2-(2-甲基-2-四氢呋喃基)四氢呋喃、3-甲基-(3H)-异苯并呋喃-1-酮和2-乙酰基-2-甲基四氢呋喃是BR-7中主要的呋喃化合物。在BR-5中，只有一种呋喃（苯并呋喃）被鉴定出。

对于含硫挥发性化合物，在本研究中，甲磺酰氯和1-丙胺，3-二苯并[b,e]硫杂苯-11(6H)-亚基-N,N-二甲基-，S-氧化物分别在BR-4和BR-5中被发现。在BR-7中未检出含硫挥发性化合物。

除了上述讨论的物质外，酸、醛、胺、苯、萘、吡嗪、吡啶、吡咯和其他物质也在红毛丹籽油中被发现。这些香气成分在三种红毛丹籽油中具有显著差异。吡啶类仅在BR-5中被检出，吡咯类只在BR-4中被发现。关于酮和萘，这类化合物在BR-5中的水平要显著高于其他两种油样（图2G）。

2.1.2 红毛丹籽油香气成分的多元统计分析

为了进一步比较不同红毛丹籽油的风味组学特征，发现种间差异，对样本进行了多元统计分析。PCA模型被首先用来初步发现不同品种红毛丹籽油间的总体差异。如PCA模型的3D得分图所示(图3A)，所有样本被分为独立的三个簇，表明组间的香气轮廓具有显著差异。成分1和成分2分别占总方差的53.70%和46.00%，模型的R2Xcum为0.997。Loadingplot和Biplot图被用来进一步解释变量对样本的贡献(图3B, C)。乙醇在BR-4中的贡献要高于BR-5和BR-7。1,2,3,4-四氢-6-甲基-萘在BR-5中的作用大于其他油样。2-甲基庚酸是促进BR-7与BR-5和BR-4区分的贡献者。此外，具有非监督学习特性的HCA（HierarchicalClustering Analysis）模型，被用来评估三种红毛丹籽油的香气轮廓的相似度。如图3D所示，9种试样被准确的聚为3类，其中BR-4和BR-7又被聚集在同一片层。这意味着BR-4和BR-7的香气轮廓具有一定的相似性。接下来，为了解更多关于挥发性化合物的差异和发现差异挥发性化合物，具有监督学习模式的OPLS-DA模型被执行。如OPLS-DA模型的3D得分图所示(图3E)，类似于PCA模型的分类趋势被观察的，R2Xcum = 0.997，R2Ycum = 1和Q2 = 1。此外，200个排列测验结果支持了模型的稳健性和预测能力（R2 = 0.161，Q2 = -0.645）(图3F)。这些结果初步证实了三种红毛丹籽油的香气轮廓具有显著差异。

为了清晰地展现样品组间差异，并筛选潜在的差异脂质分子，采用两两比较分析建立了样本间的OPLS-DA模型，即BR-4 vs BR-5、BR-4 vs BR-7和BR-5 vs BR-7。如得分图(图4A, E, I)所示，所有的成对组表现出明显地分离，这表明任意两组间的香气组成具有明显差异。此外，表3.1总结了所有OPLS-DA模型的分类参数（包括R2Xcum、R2Ycum和Q2cum）。这些数值均高于0.5，表明了所有模型的合理性。OPLS-DA模型的S-plots图提供了脂质分子的图形投影（图4C, G, K）。蓝色圆点代表VIP ≤ 1的挥发性化合物，绿色三角形代表VIP >1的挥发物质。总共17种（如2-辛醇和3-甲基丁酸戊酯）、10种（如1,2-二甲基-氮杂环丁烷和丙酸乙烯基酯）和12种（如2-氨基氰基乙酰胺和1,3-二甲基苯）挥发性化合物的VIP值大于1。这些脂质在离原点最远的正和负方向上均有分布，并且这些点与原点距离越远，其对于样本分类的贡献度越大。总的来说，不同品种红毛丹籽油中的差异挥发性物质被初步筛选出。。

表3.1 三种红毛丹籽油样的PCA和OPLS-DA模式统计参数（GC-MS）

差异倍数（Fold change，FC值）分析是一种常用于筛选样本间差异标志物的统计学方法。为了更直观地观察不同品种红毛丹籽油间香气物质含量的差异，我们计算了组间的FC值。筛选标准设置为FC >2 or < 0.5。动态分布图清晰地展示了两组间所有香气物质的含量变化（图5A, C, E），前10个上调和下调的成分被突出显示。在BR-4 vs BR-5中2,3,4-三甲基-1-戊醇和1-乙基-2,4-二甲基-苯分别是上调和下调最显著的差异化合物。在BR-4和BR-7比较中，乙醇显著上调，而草酸丁基环丁基酯显著下调。在BR-5 vs BR-7中，1-乙基-2,4-二甲基-苯具有最高的FC值，3-甲基丁酸戊酯具有最低的值。紧接着，t检验得到P值也被作为一个筛选指标，并设定为P < 0.05。火山图被用来可视化成对组间挥发性化合物含量的差异，横坐标为Log2FC值，纵坐标表示-Log10P值(图5B, D, F)。每一个点代表一个挥发性物质，灰色代表没有显著性差异，红色代表上调，蓝色代表下调。在FC >2 or < 0.5和P < 0.05这一筛选标准下，100种差异挥发性物质在BR-4 vs BR-5中被筛选出。在这100种差异物质中，61种（如十四烷酸、10,13-二甲基-甲酯和2,3,4-三甲基-1-戊醇等）为显著上调，39种（如苯、1-乙基-2,4-二甲基-和2'-甲基-苯丙酮等）为显著下调。在BR-4和BR-7的比较中，86种潜在的差异挥发性化合物被筛选出，其中49种（如乙醇等）为下调，37种（如草酸、丁基环丁基酯等）为上调。在BR-5和BR-7的比较中，91种差异物质被筛选出，包括51种（如4-(1-苯基-2-丙烯氧基)-苯甲醛等）上调和40种（如3-甲基丁酸戊酯等）下调。

基于上述讨论的筛选标准，即VIP > 1、FC > 2 or < 0.5和P<0.05，在BR-4 vsBR-5中，16种关键差异挥发性物质被确定，包括1种吡咯类、1种萘类、2种酮类、1种碳氢化合物、1种呋喃、3种酯类、4种苯类、2种醇类和1种酸类(图6A, D, G)。在BR-4和BR-5比较中，10种差异香气物质被筛选出，由1种吡咯类、1种酮类、1种碳氢化合物、6种酯类、1种胺类组成(图6B, E, H)。此外，12种差异挥发性物质（如2-辛醇和草酸丁基环丁基酯）在BR-5 vs BR-7中被过滤出（图6C, F, I）。通过整合两两比较的结果，总共21种挥发性物质被视为潜在的具有生物学意义的标志物。为了进一步了解这些差异香气成分的分布情况，我们对两两比较实验筛选得到的21种差异挥发性成分进行了交叉。如Venn图(图6J)如所示，3-甲基丁酸戊酯是唯一一种在三组成对比较中同时筛选出的化合物。四种挥发性化合物（如1,2-二甲基-氮杂环丁烷和丙酸乙烯基酯）同时出现在BR-4 vs BR-5和BR-4 vs BR-7。5-(环己基甲基)-2-吡咯烷酮、乙酸仲丁酯、草酸丁基环丁基酯、2-氰基-3-甲基-丁酸乙酯和2-氨基氰基乙酰胺被BR-4 vs BR-7和BR-5 vs BR-7共享。6种挥发性化合物在BR-4 vs BR-5和BR-5 vsBR-7筛选出。如图6K, L所示，这些差异物质主要为酯类，且他们的含量随着品种的不同而显著变化。总的来讲，这21种香气成分可以用来作为区分提取自三个红毛丹品种籽油的潜在的生物标志物

2.2 基于HS-GC-IMS的红毛丹籽油特征香气成分分析

2.2.1 红毛丹籽油的GC–IMS地形图

采用HS-GC-IMS对不同品种红毛丹籽油的挥发性有机物进行了分析。3D地形图（图7A）显示了三种红毛丹籽油的总香气。X轴代表测量运行时间，Y轴代表离子迁移时间，Z轴代表峰值强度。相似的图像和不同的峰强度意味着三种红毛丹籽油间香气成分具有差异。

为了了解香气成分的变化，红毛丹籽油的3D地形俯视图被绘制（图7B）。横坐标代表离子迁移时间，纵坐标代表保留时间。图中每个点代表一个香气物质。大多数信号发生在0-700 s之间，离子迁移时间为1.0-1.75 s。此外，以BR-4中的挥发性化合物的含量为标准值，其它组的值从标准值中减去，如图7C。颜色的程度表示样本间挥发性物质的浓度差异：白色代表类似的值，红色代表更高的值，蓝色代表更低的值。明显地，三种红毛丹籽油挥发物含量差异明显。然而，在现阶段很难准确地确定风味物质的种类。

2.2.2 基于HS-GC-IMS的红毛丹籽油香气成分的差异

为了解释不同品种红毛丹籽油的挥发性化合物变化，利用所有分析信号，通Gallery plot自动生成指纹图谱(图8)。每一行表示一个样本，每一列表示一个挥发性物质。色度表示化合物的含量水平，颜色越亮表示含量越高。整体上看，三种红毛丹籽油中挥发性成分含量差异显著。

为了进一步了解红毛丹籽油中挥发性化合物的差异，对检出的挥发性物质进行了定性分析，结果呈现在图9和表3.2。总共有35种挥发性化合物被检出通过GC-IMS，包括3种酸类、8种醇类、12种醛类、1种苯类、3种酯类、2种碳氢化合物、5种酮类和1种吡嗪类。值得注意的是，有些化合物表现出对应于单体和二聚体的双峰。这种现象是可能的，因为具有高质子亲和力的化合物可以使离子在离子迁移槽中移动时形成二聚体。醛类是红毛丹籽油中最重要的挥发性物质，其次为醇类、酮类和酸类（图10A, B）。类似的结果也在百香果籽油和瓜蒌籽油中被发现。此外，35种挥发性物质的簇状热图被用来进一步展示红毛丹籽油香气特征（图10C）

表3.2 使用GC-IMS分析红毛丹籽油得到的挥发性化合物

为了有效地调查各类挥发性物质在不同品种红毛丹籽油样中的差异，我们基于同一类挥发性物质峰面积之和进行了比较，结果可视化为热图（图10D）和柱状图（图10E）。

在我们的研究中，总共12种醛类被检出。样本间醛类化合物的水平具有显著差异（图10E），BR-5中的含量要显著高于其它组。正戊醛、(E)-2-壬醛和4-甲基苯甲醛分别是BR-4、BR-5和BR-7中最丰富的醛类化合物。此外，2-甲基戊醛、1-己醛(M)、正辛醛、1-己醛(D)、正壬醛(M)、正壬醛(D)和(E)-2-壬醛也是主要的醛类化合物，是红毛丹籽油风味特征的主要贡献者。这些醛类多数为脂肪酸的氧化产物。

吡嗪类化合物出现在食品中通常是可取的，因为它对某些风味有贡献，如坚果味和面包味等气味。这类化合物通常与非酶促褐变反应有关。在本研究中，只有一种2,6-二甲基吡嗪在红毛丹籽油中被鉴定出，通过GC-IMS分析。如图10E所示，这个挥发性物质在BR-7中的含量约是BR-4和BR-5中含量的6倍高（P < 0.05）。

酸类化合物主要源于甘油三酯的分解和游离脂肪酸的氧化，这导致了红毛丹籽油的油味。在本研究中，共检测出来3种酸，包括2种饱和酸（丁酸和丙酸）和1种不饱和酸（(E)-2-丁烯酸）。值得注意的是，BR-4中(E)-2-丁烯酸、丁酸和丙酸的含量显著高于BR-4和BR-7。

除了上述讨论的挥发性化合物外，醇类（8种）、酮类（5种）、酯类（3种）、碳氢化合物（2种）和苯类（1种）在红毛丹籽油中也被检出，通过GC-IMS方法。就醇类而言，8种醇类，包括(3E)-己烯醇、2-甲基-1-丁醇，1-己醇、2-乙基-1-己醇、1-戊醇、2-丁醇、2-甲基-3-呋喃硫醇和3-甲基-3-丁烯-1-醇在本研究中被鉴定出。整体看，BR-7中醇类化合物的含量显著高于其它两组。

2.2.3 基于HS-GC-IMS的红毛丹籽油香气成分的多元统计分析

为了初步区分不同品种红毛丹籽油，采用PCA模型对9个样本进行分析。PCA的3D得分图表明所有样本被很好的分为3个独立的组（图11A），这意味着样本间香气轮廓存在显著差异。前两个变量解释了大部分的总变量，其中成分1和2分别占56.40%和27.30%。载荷图和Biplot图可以作为PCA评分图的附加信息（图11B, C）。例如，(E)-2-丁烯酸在BR-4的贡献高于BR-5和BR-7。1-戊醇对BR-5中的贡献大于其它组。1-己醇是BR-7区分于BR-4和BR-5主要的助力者。紧接着，层次聚类分析，被用来发现样本间的差异和相似度。根据数据集的本身特征，样本被分为三个组(图11D)。明显地，Group2和Group3被归类到同一层级，这意味与BR-4相比，BR-5和BR-7的香气轮廓更接近。这些结果初步确定三种红毛丹籽油香气轮廓具有一定差异。

此外，建立具有监督模式的OPLS-DA模型来提取样本聚类信息，筛选组间潜在的香气标志物。与PCA模型类似，样本被分为三个不同的聚类，但它们之间的联系更加紧密(图11E)。OPLS-DA模型的R2Xcum、R2Ycum和Q2分别为0.837、0.996和0.989，表明模型具有好稳定性和可预测性。此外，200个交叉验证试验的结果为(R2 = 0.515，Q2 = -0.743)表明模型的合理性和有效性(图11F)。

为了进一步了解三种红毛丹籽油间香气轮廓的差异和更准确的筛选差异代谢物分子，基于成对比较的OPLS-DA模型被执行。如图12A, D, G所示，所有两两比较的组别均被明显地分开，这表明任意两组的挥发性物质具有显著的差异。S-plots图提供了挥发性物质的图形投影，VIP > 1的化合物被以橙色突出(图12B, E, H)。基于VIP > 1这个筛选参数，总共11种（包括正戊醛和乙酸乙酯）、10种（包括(E)-2-丁烯酸和4-甲基苯甲醛）和8种（包括4-甲基-2-戊酮和1,2-二甲苯）分别在BR-4 vs BR-5、BR-4 vs BR-7和BR-5 vs BR-7被筛选出。这些香气化合物与原点距离越远，其对于样本分类的重要性越大。模型的所有验证参数被总结在表3.3中，表明模型的强的可靠度。总的来说，OPLS-DA分析可以用于初步筛选不同品种红毛丹籽油中潜在的差异挥发性化合物。

FC分析可以直观地观察挥发性化合物在两比较组间的倍数关系。在本研究中，我们计算了各成对组中香气物质的FC值，并设置过滤标准为FC > 2 or < 0.5。动态分布图(图13A, C, E)展示了所有差异挥发性化合物的FC值，前5个变化最显著的分子被以红色（上调）和蓝色（下调）突出。在BR-4 vs BR-5中，1-乙酸丁酯和1,2-二甲苯显著上调，而(E)-2-壬醛和正壬醛(D)显著下调。与BR-7相比，正戊醛和(E)-2-丁烯酸在BR-4中显著增加，而1-己醇和正壬醛(M)则显著降低。在BR-5和BR-7比较中，乙酸乙酯和环己酮呈上调，而2,6-二甲基吡嗪和1,2-二甲苯呈下调。

接下来，为了更准确地筛选潜在的差异香气物质，t检验得到P值也被引入作为筛选标准，并设定为P < 0.05。以横坐标为Log2FC值和纵坐标为-Log10P值构建的火山图被用来可视化组间香气化合物含量的变化（图13B, D, F）。每一个点代表一个挥发性化合物，蓝色代表差异代谢物下调，红色代表差异代谢物上调，灰色代表没有显著性差异。筛选标准固定为FC > 2 or < 0.5和P < 0.05。总共有16种（6上调和10下调）、14种（3上调和11下调）和9种（3上调和6下调）差异香气物质被过滤出。

上述讨论的筛选标准（VIP>1, FC>2 or <0.5, 和P<0.05）被整合用来确定关键的差异化合物分子，结果如Venn图所示(图14A, D, G)。在BR-4 vs BR-5中，11种潜在的差异挥发性化合物被过滤出。在这11种化合物中，BR-4中正壬醛(D)、环己酮、乙酸乙酯、2-甲基-2-丙烯醛、(E)-2-戊烯醛和(E)-2-壬醛的含量显著低于BR-7，而正戊醛、4-甲基苯甲醛、乙酸1-丁酯、1,2-二甲苯和(E)-2-丁烯酸显著高于BR-7（图14B, C）。总共8种差异挥发性物质在BR-4 vs BR-7中筛选出，其中3种化合物（正戊醛、1-乙酸丁酯和(E)-2-丁烯酸）在BR-4中的含量要显著高于BR-7。而剩下的5种挥发性化合物，包括庚醛、环己酮、2,6-二甲基吡嗪、(E)-2-戊烯醛和(3E)-己烯醇，在BR-4中的含量显著低于BR-7（图14E, F）。7种潜在的差异香气成分在BR-5和BR-7的成对比较中筛选出，其中环己酮、乙酸乙酯和(E)-2-壬醛在BR-5中的水平要显著高于BR-7。相反地，BR-5中4-甲基苯甲醛、2-甲氧基-2-甲基丙烷、2,6-二甲基吡嗪和1,2-二甲苯的含量显著低于BR-7（图14H, I）。

最后，通过整合成对比较的结果，总共15种挥发性物质被视为潜在的具有生物学意义的香气标志物，其中2种（正壬醛(D)和2-甲基-2-丙烯醛）、2种（庚醛和(3E)-己烯醇）和1种（2-甲氧基-2-甲基丙烷）分别只在BR-4 vs BR-5、BR-4 vs BR-7、和BR-5 vs BR-7筛选出(图15A)。热图被用来进一步展示这15种关键差异挥发性物质的含量变化，绝大多化合物的含量最高值在BR-7中发现（图15B）。有趣的是，这些挥发性化合物多属于醛类化合物（图15C），这意味着这类化合物在红毛丹籽油的风味特征中具有重要的作用。

三、结论

本发明建立了GC-MS联用GC-IMS技术测定红毛丹籽油中特征香气成分的定性定量分析方法。实验结果表明，该方法灵敏度高，回收率高，重复性好，可用于红毛丹籽油中特征香气成分的检测，为红毛丹加工研究提供了新的思路和技术支持。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。