肠道粪杆菌及其代谢物s-7-p作为脑动脉瘤预测标志物的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及肠道粪杆菌及其代谢物景天庚酮糖-7-磷酸(s-7-p)作为脑动脉瘤预测标志物的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

脑动脉瘤(CA)为动脉壁局灶性、囊状性突出，多见于前交通动脉、后交通动脉、大脑中动脉、大脑前动脉、椎动脉、基底动脉等，根据形状，CA通常分为两类：囊状动脉瘤和夹层动脉瘤。CA在全球普通人群中的总患病率约为3.2％，其中，成人中未破裂CA的发生率在1％-8％之间。一旦CA破裂并出血，如蛛网膜下腔出血(SAH)等，将导致一种严重的脑血管疾病，具有极高的残疾和死亡率。统计数据显示，约50％的CA破裂患者预后不良，可导致死亡或严重的残疾后遗症。

在临床实践中，当患者被诊断患有未破裂CA后，一般首选动脉瘤夹闭或介入手术进行治疗，往往根据患者年龄、动脉瘤大小、形态、位置、类型等因素进行个性化综合考虑，指导临床决策。不幸的是，目前没有明确的生物标志物来进行指导未破裂CA的术后预后。因此，一些破裂风险较低的患者可能会错误地认为是手术治疗的并发症，而一些高危患者可能会因手术失败而发生动脉瘤破裂。

目前的CA检测技术存在许多缺陷，如CTA或MRA，需要患者注射造影剂或需要较大的器械。越来越多的证据表明，肠道微生物群是影响宿主代谢和免疫稳态的关键环境因素。近年来，人们对人类微生物群在高血压、心力衰竭和动脉粥样硬化等心血管疾病中的作用也引起了人们的关注。研究表明，肠道微生物群在这些疾病中产生大量的代谢物，并被体循环吸收，在那里它们被宿主酶进一步代谢，引发对靶器官的损伤。最近的另一项研究报告称，使用抗生素消耗肠道微生物群可以降低小鼠中CAs的发生率。也有研究表明相关牛磺酸缺乏是CA发病机制的潜在关键因素。然而，肠道菌群组成和代谢物变化在CA患者中的作用和确切机制尚不确定。因此，目前还没有可用于CA检测的微生物群或代谢物生物标志物，也没有微生物学策略来干预CA的发展。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供肠道粪杆菌及其代谢物景天庚酮糖-7-磷酸(s-7-p)作为脑动脉瘤预测标志物的应用。本发明共纳入了108例未破裂CA患者和40例健康个体作为研究对象，并采集了他们的血液和粪便样本。通过分析血液、粪便细菌和代谢物中显著改变的成分之间的相关性，筛选差异参数并构建预测模型，并通过新采集的CA样本成功验证预测模型的准确性。

为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：

第一方面，本发明提供了检测肠道粪杆菌及其代谢物景天庚酮糖-7-磷酸的物质在制备预测脑动脉瘤产品中的应用，所述脑动脉瘤产品用于预测受试者为脑动脉瘤患者或正常。

优选的，所述脑动脉瘤包括囊状动脉瘤或夹层动脉瘤。

优选的，肠道粪杆菌及其代谢物景天庚酮糖-7-磷酸来自受试者的待测样品，所述待测样品包括受试者粪便样品。

优选的，所述产品中含有记载有判断标准的载体，所述判断标准为如果受试者的肠道粪杆菌及其代谢物景天庚酮糖-7-磷酸水平高于标准对照，则预测受试者为脑动脉瘤患者。

进一步优选的，所述标准对照为正常个体的肠道粪杆菌及其代谢物景天庚酮糖-7-磷酸水平。

第二方面，本发明提供了检测肠道粪杆菌代谢物景天庚酮糖-7-磷酸的物质在制备脑动脉瘤术后预后产品中的应用。

第三方面，本发明提供了一种产品，所述产品包括用于检测肠道粪杆菌及其代谢物景天庚酮糖-7-磷酸的物质，所述产品用于预测受试者为脑动脉瘤患者。

优选的，所述产品包括检测待测样品中肠道粪杆菌及其代谢物景天庚酮糖-7-磷酸的相对丰度和/或数量的试剂、装置和/或设备。

优选的，所述产品包括试剂盒。

第四方面，本发明提供了一种系统，包括：

i)分析单元，所述分析单元包含：用于确定受试对象的待测样品中肠道粪杆菌及其代谢物景天庚酮糖-7-磷酸的相对丰度信息的检测物质，以及；

ii)评估单元，所述评估单元包含：根据i)中确定的所述肠道粪杆菌及其代谢物景天庚酮糖-7-磷酸的相对丰度信息预测受试对象是否为脑动脉瘤。

上述本发明的一种或多种技术方案取得的有益效果如下：

健康对照组与CA组之间不仅在肠道微生物群、代谢物和血液组成方面存在显著差异，而且在两者之间的相互作用方面也存在显著差异。经QPCR随机森林模型分析和QPCR验证后，粪杆菌和s-7-p对动脉瘤的预测准确率为99.7％，证实了肠道细菌粪杆菌和代谢物s-7-p作为CA预测的潜在生物标志物的作用。

s-7-p与CA术后预后相关代谢物具有相关性，可以作为CA术后预后的潜在生物标志物。

粪杆菌和s-7-p可结合作为一种非侵入性、廉价和敏感的生物标志物，有效提高CA的检测效率，降低检测成本。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为CA患者(CAS1)与健康对照组(NS1)的微生物α-多样性的变化对比图，包括chao1估计丰富度、观测特征、Shannon’s和Simpson’s多样性；

图2为用加权unifrac_t检验和PCoA图说明CA患者(CAS1)与健康对照组(NS1)的β多样性的差异；

图3为CA患者(CAS1)与健康对照组(NS1)的肠道菌群的LEfSe分析；

图4为CA组和健康对照组的粪便微生物群中的厌氧菌含量对比；

图5为CA患者(CA)与健康对照组(N)的阴离子和阳离子代谢物的PLS-DA差异；

图6为CA患者(CA)与健康对照组(N)的可变重要性VIP值的差异；

图7为CA患者(CA)与健康对照组(N)的阴离子和阳离子的代谢途径富集分析；

图8为随机森林模型筛选和评价粪便细菌、代谢物和血液参数的差异；

图9为g_Faecalibacterium、s-7-p和平均红细胞宽度联合构建预测模型的ROC曲线；

图10为g_Faecalibacterium和s7p构建预测模型的ROC曲线；

图11为仅用g_Faecalibacterium构建的预测模型的ROC曲线；

图12为对新采集的12份样品进行实时荧光定量PCR检测，验证g_Faecalibacterium的含量，其中，*,<0.05；**,<0.01；***,<0.001；****,<0.0001；

图13为与s-7-p显著相关的代谢产物。

具体实施方式

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

本研究经山东大学基础医学科学学院伦理委员会(中国山东省济南)审定，批准号为ECSBMSSDU2023-1-82。所有志愿者在纳入研究前均给予了书面的知情同意。所有方法均按照相关的指南和规定执行。为了研究CA患者和健康人群的肠道菌群，选取108例CA患者和40例健康志愿者[常规体检40例对照，山东大学(中国山东济南)齐鲁医院住院108例CA患者；CA患者包括85例囊状动脉瘤患者(A)和23例夹层动脉瘤患者(D)]。取志愿者的粪便样本，两组的粪便样本均提取微生物DNA。粪便样本保存在-80℃，用于后续的DNA提取和测序。

16S测序

采用CTAB/SDS法提取粪便总基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳检测提取基因组的浓度和纯度。用无菌水稀释DNA至浓度为1ng/μl。利用约10ng的模板DNA和0.2μM具有适配器和条形码的引物，用

采用随机森林算法对样本分类进行预测，进一步探讨粪便微生物群与CA的关系。采用基于5倍交叉验证的1000棵回归树进行随机森林回归，随机选取80％的样本进行模型训练，其余20％用于验证。预测结果由roc曲线显示：“proc”。在随机森林预测分类算法中，可以知道不同属的贡献。

16S rRNA基因PCR分析

提取的基因组DNA用PCR法检测弯曲杆菌。每个反应混合物包括2×SYBRPremixUrTaqTMII(不含Rox)，0.2μM浓度的16S rRNA基因特异性引物和20ng的基因组DNA，最终体积为20μL。

质谱分析代谢物

样品与甲醇混合，加入内标品(L-2氯苯丙氨酸，1mg/ml dh2o溶液)。所有样品在冰水中超声波提取10min，4℃下12000rpm离心15分钟，收集上清。非靶向代谢物筛选在Q萃取轨道阱质谱仪(热科学，Waltham，MA，美国)上进行。采用Fullms ddMS2方法选择QC样品，并设置多个扫描片段，获得更多的二级数据进行鉴定。样品分别在正离子模式和负离子模式下运行。制备标准化样品以进行质量控制。alpha指数(PD_whole_tree)和距离矩阵(加权UniFrac)采用QIIME软件(1.9.1)进行统计分析。其他分析和图片采用Rstudio软件(R版本i386 3.6.2)进行。采用Alpha多样性测定法分析了每个样品的物种多样性的复杂性。alpha多样性的差异采用Wilcoxon秩和检验。主坐标分析(PCoA)用于检验纯素食(2.5-6)和ggplot2(3.3.3.0)软件包对样本复杂性的差异。门或种中微生物的差异分析采用Wilcoxon检验(p值＜0.05)，热图由家系图包(1.0.12)生成。皮尔逊相关系数采用psych(1.9.12.31)计算，网络采用细胞景观(版本：3.6.1)可视化(绝对皮尔逊≥0.6，p值＜0.05)。利用质谱数据转换软件将质谱数据转换为mzML格式。然后，使用XCMS(1.50版)软件对数据进行处理，包括峰值搜索和峰值对齐。最后，使用OSI-SMMS软件(第2.0.0版，大连化学数据解决方案信息技术有限公司)进行物质鉴定。首先计算正负离子数据作为相对丰度，保留ms2.评分>为0.5的数据，合并后用于数据分析。不同代谢物采用R工作室软件(3.6.2版)进行Wilcoxon检验分析(p＜0.05)。利用KEGG数据库(https://www.metaboanalyst.ca/home.xhtml)对差异代谢物进行途径富集分析。当p<值为0.05时，认为通路发生了显著改变。利用R工作室软件生成不同物种与所有或不同代谢物之间的网络，用Cytoscape(版本：3.6.1)进行可视化(相关性>|0.6|，p<0.05)。

所有数据以平均±标准差(SD)表示，每个实验均有3个重复数据。采用student t检验计算组间p值，p<0.05(*)认为有统计学意义。

CA患者中有85例囊状动脉瘤(A)和23例(D)夹层动脉瘤被纳入本研究。在CA患者组中招募的所有个体都通过影像学进行诊断。A型或D型患者血液中5-核苷酸酶、腺苷脱氨酶、氯、氯、D-二聚体、红细胞、平均红细胞宽度、血细胞压积和凝血酶原标准化比值存在差异。上述变化分别代表了心脏功能、肝脏功能、凝血功能、红细胞功能和电解质相关功能的差异。在动脉瘤特征方面，A和D之间的动脉瘤位置分布无差异，但RAs的大小大于A(P＝0.0017)。

随着序列数的增加，所有样本的观察特征都趋于饱和，说明数据中的OTUs覆盖了样本中的大部分reads。t检验显示囊状动脉瘤和夹层动脉瘤患者的α多样性指数高于健康个体(P value<0.05)(图1)，包括Chao1估计丰富度、观察特征、以及香农和辛普森的多样性，证实了患者和健康人之间的样本内微生物多样性的改变。值得注意的是，上述α多样性指数在囊状动脉瘤和夹层动脉瘤患者之间无显著差异，说明脑动脉瘤患者肠道微生物群的微生物丰富度和均匀度具有一致性。

粪便微生物群β-多样性的weighted_unifrac_t检验显示，患者和健康对照组之间存在显著差异(图2，p<0.01)。PCoA图验证的结果βweighted_unifrac_t-test多样性，和获得的p值(排列方差)分析细菌变异<0.001，表明改变样本之间的肠道微生物多样性与脑动脉瘤的发生。对于囊状动脉瘤和夹层动脉瘤的β-多样性指标可能存在的差异，weighted_unifrac_t-检验结果和PCoA图显示两组间无明显变化。上述结果表明，当脑动脉瘤发生时，样本内和样本间的微生物多样性均发生了显著的变化。

为了阐明CA对口腔微生物群的影响，在不同的分类水平上比较了口腔微生物群的结构。健康人群和脑动脉瘤组的优势门为厚壁菌门和拟杆菌门，这两个门分别占对照组微生物群的43.2±23.6％和14.1±20.5％；而患者组的含量分别变为61.2±20.6％和14.4±15.4％。在属水平上，粪杆菌和大肠杆菌-志贺氏菌是患者组中最丰富的两个属，对照组以拟杆菌和双歧杆菌丰度为主。LEfSe分析显示，(k_Bacteria；p_Firmicutes；c_Clostridia；o_Clostridiales；f_Lachnospiraceae；g_Blautia)，属(k_Bacteria；p_Firmicutes；c_Clostridia；o_Clostridiales；f_Veillonellaceae；g_Dialister)，(k_Bacteria；p_Firmicutes；c_Clostridia；o_Clostridiales；f_Ruminococcaceae；g_Faecalibacterium)，普氏菌(k_Bacteria；p_Bacteroidetes；c_Bacteroidia；o_Bacteroidales；f_Prevotellaceae；g_Prevotella)及其部分亲本分类单位在脑动脉瘤患者的粪便微生物群中明显过多。而甲烷短杆菌(k_Archaea；p_Euryarchaeota；c_Methanobacteria；o_Methanobacteriales；f_Methanobacteriaceae；g_Methanobrevibacter)和(k_Bacteria；p_Firmicutes；c_Clostridia；o_Coriobacteriales；f_Coriobacteriaceae；g_Collinsella)相关的分类单位在对照组中代表过多。Lefse结果通过t检验分析验证，其高丰度的差异菌群一致(图3)。与对照组相比，没有粪杆菌含量大于10％的样本，32.9％(27/85)的囊状动脉瘤，30.4(7/23)的夹层动脉瘤超过了这个值。但囊状动脉瘤组与夹层动脉瘤组的对比比较较小，仅f_Veillonellaceae和O_Lactobacillales的含量存在显著性差异。以上结果表明，CA处理后的肠道菌群发生了显著变化。虽然患者组中一些专性厌氧菌属的丰度下降，如g_Methanobrevibacter、g_Collinsella，但其他一些厌氧属如g_Blautia、g_Dialister、g_Faecalibacterium和g_Prevotella的含量增加；提示CA患者肠道菌群无氧依赖性转移。两组样品中专性厌氧菌含量的差异进一步证实了这一假设(图4)。

为了探讨代谢物与脑动脉瘤的相关性，采用LC-MS系统研究了患者与健康对照组之间粪便代谢物的差异。在确认数据质量控制后，在健康和动脉瘤性患者的粪便中发现了941个阴离子和1856个阳离子代谢物。采用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)对患者与对照组之间存在差异的代谢物进行分析。正离子的PLS-DA与负离子的DA存在显著差异(图5)，大部分样品被分离，说明两组间代谢物含量存在差异。基于变量的重要性投影(VIP)值，一些代谢物可能更大的贡献脑动脉瘤，如景天庚酮糖-7-磷酸(s-7-p)，N4-(5-chloro-4-methoxy-3-thienyl)-2,6-dimethylmorpholine-4-carboxam ide，17二磷酸(S17BP)和香叶酰pp，以及正离子N-{6-[(5-chloro-3-pyridyl)oxy]-3-pyridyl}-N’-methylurea，吡啶醇、N甲基色胺和辛胆酚(图6)。然后将差异代谢物导入京都基因和基因组百科全书(www.kegg.jp)，进行代谢途径匹配分析，并确定脑动脉瘤相关的代谢途径。图7总结了癌症中富集的代谢途径，碳代谢和中心碳代谢分别是阴离子代谢产物和阳离子代谢产物中P值最低的信号通路。以上代谢物富集结果突出了碳水化合物代谢在脑动脉瘤中的作用。

为探讨肠道微生物群、代谢物和血液常规参数之间的相互关系，采用Spearman相关分析方法分析健康人群和患者样本中它们的相关性。过滤掉与|斯皮尔曼相关系数|<0.4和Q-value>0.01的弱关联后，粪杆菌属和玫瑰菌属脱颖而出，它们是相互关联的。除了与景天庚酮糖-7-磷酸(s-7-p)、N{6-(5氯吡啶)氧-3吡啶基-甲基脲负相关外，N4-(5-chloro-4-methoxy-3-thienyl)-2,6-dimethylmorpholine-4-carboxamide，单片糖-1,7-二磷酸，香叶酰-pp，

3(4氯苯基)5甲基2、5二氢1、2、4恶二唑、4氯2(1H吡唑3基)苯酚，N-(1、2、3、4-四氢-1-萘基)苯磺酰胺和N-(3-cyano-2-thienyl)-2,3-dihydro-1-benzofuran-5-carboxamide，4-甲基-2-氧戊酸、N-甲基色胺、粪杆菌分别与N1-苯基-3、3、3-三氟-2-(三氟甲基)丙酰胺有关，2′-脱氧鸟苷5′-一磷酸(dGMP)、拉帕醇、奥西泮-d5和酪醇，而玫瑰菌与3-(3-硝基苯)-2-苯丙烯酸、5-(2-pyridinyl)-N-[2-(trifluorome-thyl)phenyl]-2-thiophenesulfonamide，和5-[4-(苯磺酰)苯基]-1H吡唑相关。此外，还发现与酪醇和3,5-二甲基4H吡唑414-(3,5-二氯苯)肼有关。这些结果表明，上述细菌可能在脑动脉瘤发生过程中的碳水化合物代谢中起着重要的调控作用。

然后研究了粪便细菌和代谢物与血液常规参数的相关性。数据表明，双歧杆菌与血液参数的相关性最大，包括红细胞、血红蛋白、红细胞压积、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、伽马-谷丙酰转肽酶、碱性磷酸酶、腺苷脱氨酶、总胆红素、直接胆红素、胱抑素C和血清超敏肌钙蛋白。振荡杆菌，仅次于双歧杆菌，与之相关的血液参数为嗜碱性粒细胞计数、红细胞、血红蛋白、红细胞压积、伽马-谷丙酰转肽酶、a-l-核苷酶、前白蛋白、白蛋白、5-核苷酸酶和氯。值得注意的是，粪杆菌与小密度脂蛋白和缺血性修饰白蛋白相关，这些白蛋白已被证明与其他疾病中的动脉粥样硬化或缺血性中风相关。相反，氯和磷在血液参数中的相关性最大，氯与菌属、梭菌属、黄孢菌属、毛螺旋菌科和振荡杆菌相关，磷与丁酸菌属、梭菌属、梭菌属、梭菌属、红菌属和黄孢菌相关。

在代谢物与血液参数的相互作用方面，N4-(5-chloro-4-methoxy-3-thienyl)-2,6-dimethylmorpholine-4-carboxamide和N-(5-acetyl-2-chlorophenyl)-4-isopropylbenzenesulfonamide与血液参数的相关性最大，其丰度与凝血酶原标准化比值、平均血红蛋白含量、平均血小板体积、直接胆红素、同型半胱氨酸、肌酸激酶、肌酸激酶同功酶、血清超敏肌钙蛋白、5-核苷酸酶、凝血酶原时间量、凝血酶原标准化比值、凝血酶原时间活性、凝血酶原时间比值、单核细胞比值、平均血小板体积、高密度脂蛋白胆固醇、血清载脂蛋白A1、5-核苷酸酶、钙、磷分别升高。值得注意的是，s-7-p与同型半胱氨酸和5-核苷酸相关，前者是中风分子和卒中的独立危险因素，而后者是肝功能的指标。另一方面，在血液参数中，5-核苷酸酶、平均血小板体积和单核细胞比值与代谢物的相互作用最多。以上相关结果表明，部分肠道细菌和代谢物与宿主血液参数有关，可能具有重要的生理功能。

为了探讨利用差异细菌和代谢物来评估脑动脉瘤风险的可行性，采用随机森林分类器模型进行组预测。随机森林模型的数据准备采用5倍交叉验证，即首先将原始数据随机分为每个年龄组的5个子组，然后以一个随机子组作为测试集，其余4个子组作为训练组。细菌种类和代谢物丢失或出现在每组，以及那些显著改变他们的内容作为生物标志物后续随机森林分类，和ROC曲线分析来评估分类样本的准确性。首先使用微分粪便细菌、代谢物和血液参数评估随机森林模型，如图8所示，粪便细菌属(ASV23)，粪便细菌(ASV5)，粪便代谢物s-7-p(META2781)以及血液常规参数红细胞(CLINIC9)有很大影响某些脑动脉瘤预测模型的准确性。然后将这些平均下降精度较高的因素随机合并，构建预测脑动脉瘤的预测模型，结果显示，由g_Faecalibacterium、s7p和平均红细胞宽度组合建立的模型的ROC获得的AUC最高(图9)。然而，对该预测模型的分析显示，g_Faecalibacterium、s7p和平均红细胞宽度的Pr(>|z|)值均为>0.05。如果仅使用g_Faecalibacterium和s7p构建预测模型，则ROC中的AUC为99.7％(图10)。同时，g_Faecalibacterium和s7p的Pr(>|z|)的<均为0.05，分别为0.020和0.0086。此外，仅用g_Faecalibacterium建立的预测模型的准确率为82.8％，其Pr(>|z|)值为0.001(图11)。由于realPCR可以直接检测粪杆菌，因此通过新采集的12个样本验证了g_Faecalibacterium构建的预测模型的准确性。结果显示，检测准确率为91.7％(11/12)(图12)，具有作为CA筛查生物标志物的潜力。上述随机森林模型结果显示，肠道细菌粪杆菌g_Faecalibacterium和代谢物s-7-p作为CA预测的潜在生物标志物的作用。

接下来，评估了微生物群、代谢物和血液参数作为预测脑动脉瘤预后的潜在生物标志物的可行性。采用单因素和多因素Cox回归分析，评估术后生活质量与各种肠道菌群、代谢物和血液参数的相关性。结果显示，N1-phenyl-3,3,3-trifluoro-2-(trifluoromethyl)propanamide，N4-(5-chloro-4-methoxy-3-thienyl)-2,6-dimethylmorpholine-4-carboxam ide，片聚糖1,7-二磷酸、N-(1,2,3,4-tetrahydro-1-naphthalenyl)-benzenesulfonamide，5-氨基-2-(二甲基胺)苯甲酸、拉巴醇和5-[4-(苯磺酰)苯基]-1H-吡唑在95％可信区间内与预后呈显著正相关(表3，p<0.05)。另一方面，6-(甲基磺胺酰)-9h-嘌呤、5-(2-pyridinyl)-N-[2-(trifluoromethyl)phenyl]-2-thiophenesulfonamide、RMH相对丰度较高的患者的预后明显低于其他各组(p<0.05)。尽管在如此有限的样本量下，粪杆菌或s-7-p与手术结果的相关性不显著，但上述术后预后相关代谢物N1-phenyl-3,3,3-trifluoro-2-(trifluoromethyl)propanamide，N4-(5-chloro-4-methoxy-3-thienyl)-2,6-dimethylmorpholine-4-carboxam ide，N4-(5-chloro-4-methoxy-3-thienyl)-2,6-dimethylmorpholine-4-carboxam ide，1,7-二磷酸、N-(1,2,3,4-tetrahydro-1-naphthalenyl)benzenesulfonamide和拉帕醇均与粪杆菌和s-7-p相关(图13)。总之，这些结果强调了改变的肠道细菌和代谢物作为CA预测和术后预后的潜在生物标志物的意义。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。