基于核酸适体的膀胱癌标志物蛋白检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及基于核酸适体的膀胱癌标志物蛋白检测试剂盒。

背景技术

目前膀胱镜检查是诊断膀胱癌最可靠的方法，也是金标准，但膀胱镜检查作为侵入性方法具备有创性，会使患者承受一定的痛苦，且检查费用也较昂贵。因此，当今有关膀胱癌诊断方法的研究均向非侵入性、无创性集中。目前膀胱癌无创的尿液检测方法主要有：尿液脱落细胞学、荧光原位杂交（FISH）、DNA甲基化标志物。尿液脱落细胞学是对尿液中脱落细胞进行形态学检查，该方法操作简单、特异性较高，但其在膀胱癌诊断中敏感度低而难以推广。FISH的特异性为53%-95%，灵敏度为47%-76%，其中对低级别和Ta期肿瘤的灵敏度仅为39-51%和39%-53%。近年来，以DNA甲基化标志物来诊断膀胱癌的方法逐渐在临床上推广，其灵敏度和特异性都较高，但是由于需要专业的仪器及操作人员，要采用荧光染料、耗时等。因此，这些检测方法无论敏感性还是特异性都不够理想，漏诊率和误诊率较高。

随着尿液肿瘤标志物的研究不断发展，一些非核酸类的尿肿瘤标志物也广泛被研究，例如肿瘤相关蛋白、外泌体等。尿液中含有大量蛋膀胱癌相关肿瘤蛋白标志物，例如核基质蛋白（NMP22）、膀胱肿瘤抗原（BTA）、细胞角蛋白（CK）、纤维蛋白原及其降解产物（FDP）等，均可以作为膀胱癌诊断的潜在标志物。其中，NMP22是美国食品和药物管理局（FDA）批准的唯一肿瘤标志物，且相关快速检测试剂盒为FDA批准的唯一膀胱癌辅助诊断试剂盒，可用于辅助诊断新发膀胱癌以及监测治疗后癌症复发。但是，由于试剂盒主要使用可以特异性结合NMP22的抗体以制备抗体夹心法免疫层析试纸条，在灵敏度、特异性方面仍存在市场需求，且NMP22特异性抗体的筛选获得过程繁杂漫长且批间差异大，目前国内尚无同类型产品上市。

核酸适体（aptamer）是指通过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）筛选分离得到的对靶标具有高特异性、高亲和力的单链DNA或者RNA分子，其靶标非常广泛包括蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞等，在生化分析、环境监测、基础学、新药合成等研究领域有广阔的前景。相比于抗体，核酸适体具有筛选周期短、易修饰改造、稳定性好等特点，且是通过人工合成，批间差异小。

为了克服现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供基于核酸适体的膀胱癌标志物蛋白检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒能够迅速、准确地检测与识别膀胱癌标志物蛋白，从而辅助多场景下膀胱癌早期诊断及预后监测等医疗需求。

发明内容

本发明的目的在于提供基于核酸适体的膀胱癌标志物蛋白检测试剂盒，本发明利用基于NMP22蛋白的指数富集的核酸适体系统进化技术所获得两条识别不同位点的核酸适体，通过对NMP22进行核酸适体-抗体夹心或核酸适体-核酸适体夹心识别的方式制备侧向层析试纸条，实现对尿液标本中NMP22的测定。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

一种试剂盒在蛋白检测中的用途，上述试剂盒是基于核酸适体的膀胱癌标志物蛋白检测的试剂盒；

上述试剂盒中包含标记的核酸适体；

上述标记的核酸适体中的核酸适体选自SEQ ID NO1或SEQ ID NO2中的一种；

上述SEQ ID NO1的核苷酸序列为：

CGCCTCCTTCCACGGGATCGGATTCCCCACTCGGCTCTATCGGATTGGAGACGAGATCGGCG；

上述SEQ ID NO2的核苷酸序列为：

CGCCTCCTTCCTCTCGGGGTGTGTAGGGTCAGGGAGTGTGAGAGGAGGAGACGAGATCGGCG。

对本发明而言，上述试剂盒还包含样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；

对本发明而言，上述样品垫为改性玻璃纤维膜；

对本发明而言，上述改性玻璃纤维膜由4-氨基-3-异丙基-1,2,4-三唑啉-5-酮改性玻璃纤维膜获得。

对本发明而言，上述标记的核酸适体中，标记的方法选自胶体金颗粒标记法、乳胶颗粒标记法、荧光量子点标记法或荧光基团标记法中的一种。

本发明还公开了一种胶体金颗粒标记法，包括：稀释胶体金，然后加入巯基及FITC（异硫氰酸荧光素）双修饰的核酸适体，冷冻处理，离心，洗涤，重悬，获得胶体金颗粒标记的核酸适体。

具体地，上述胶体金颗粒标记法，包括：

在胶体金中加入三蒸水，至浓度为2.9-3nM，获得胶体金稀释液，然后加入巯基及FITC双修饰的核酸适体液，在-23℃至-18℃冷冻处理1.5-2.5h，然后在3-5℃，7500-8500rpm条件下离心5-8min，三蒸水洗涤2-4次，加入胶体金复溶液重悬，获得胶体金颗粒标记的核酸适体。

对本发明而言，上述胶体金稀释液与巯基及FITC双修饰的核酸适体液的体积比为：1:0.025-0.035。

对本发明而言，上述巯基及FITC双修饰的核酸适体液的浓度为90-105µM。

对本发明而言，上述胶体金稀释液与胶体金复溶液的体积比为：1:0.2-0.5。

本发明还公开了一种乳胶颗粒标记法，包括：稀释乳胶颗粒，然后加入生物素修饰的核酸适体液，室温处理，离心，洗涤，重悬，获得乳胶颗粒标记的核酸适体。

具体地，上述乳胶颗粒标记法，包括：

将乳胶颗粒液，采用三蒸水进行稀释（乳胶颗粒液与三蒸水的体积比为：1:1.5-3.5），获得乳胶颗粒稀释液，然后加入生物素修饰的核酸适体液，室温震荡0.5-1.5h，然后在3-5℃，9500-10500rpm条件下离心8-12min，三蒸水洗涤2-4次，加入点胶液重悬，获得乳胶颗粒标记的核酸适体。

对本发明而言，上述乳胶颗粒稀释液与生物素修饰的核酸适体液的体积比为：1:0.2-0.3。

对本发明而言，上述生物素修饰的核酸适体液的浓度为90-105µM。

对本发明而言，上述乳胶颗粒液与点胶液的体积比为：1:0.5-1。

本发明还公开了一种荧光量子点标记法，包括：在量子点微球中加入生物素修饰的核酸适体液，室温处理，离心，洗涤，重悬，获得荧光量子点标记的核酸适体。

具体地，上述荧光量子点标记法，包括：

在浓度为1-1.3mg/mL的量子点微球液中加入生物素修饰的核酸适体液，室温条件下震荡处理0.5-1.5h，然后在3-5℃，9500-10500rpm条件下离心8-12min，三蒸水洗涤2-4次，加入点胶液重悬，获得荧光量子点标记的核酸适体。

对本发明而言，上述量子点微球液与生物素修饰的核酸适体液的体积比为：1:0.7-0.8。

对本发明而言，上述生物素修饰的核酸适体液的浓度为90-105µM。

对本发明而言，上述量子点微球液与点胶液的体积比为：1:0.5-1。

对本发明而言，上述点胶液包含：Tris-HCl、聚乙二醇（PEG）、吐温-20（Tween-20）、蔗糖、海藻糖和牛血清白蛋白（BSA）。

对本发明而言，上述点胶液中，PEG含量为0.2-1wt%；Tween-20含量为0.1-10wt%；蔗糖含量为2-50wt%；海藻糖含量为0.2-10wt%；BSA含量为1-10wt%，余量为Tris-HCl。

对本发明而言，上述Tris-HCl的pH为7.8-8.3。

对本发明而言，上述PEG分子量18000-23000Da。

本发明还公开了一种试剂盒的制备方法，包括：

步骤一、将标记的核酸适体喷涂于结合垫上；

步骤二、在硝酸纤维素膜上进行划膜；

步骤三、将样品垫、喷涂后的结合垫、划膜后的硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴到PVC（聚氯乙烯）底板上，两两相邻粘贴物之间有重叠；然后将其切割，获得试纸条，再经组装，获得试剂盒。

对本发明而言，上述步骤一中的喷涂过程中喷量设置为1.8-2.3µL/cm。

对本发明而言，上述步骤二中划膜的方法为核酸适体-抗体夹心法或核酸适体-核酸适体夹心法。

对本发明而言，上述核酸适体-抗体夹心法，包括：检测线（T线）使用的抗体为NMP22抗体1B8，浓度为1.5-2.5mg/mL；质控线（C线）抗体选择的抗FITC抗体，划膜浓度为0.45-0.55mg/mL。

对本发明而言，上述核酸适体-核酸适体夹心法，包括：将生物素修饰的核酸适体液和链霉亲和素（SA）液在磷酸盐缓冲溶液（DPBS）中室温反应25-35min，反应完成后，使用超滤管去除未结合到SA上的核酸适体，然后将得到的交联产物用划膜液进行稀释，即得到检测线（T线）划膜溶液；C线抗体选择的抗FITC抗体，划膜浓度为0.45-0.55mg/mL。

对本发明而言，上述核酸适体-核酸适体夹心法中，生物素标记核酸适体液与链霉亲和素液的体积比为：1:0.2-0.3。

对本发明而言，上述核酸适体-核酸适体夹心法中，生物素标记核酸适体液与磷酸盐缓冲溶液的体积比为：1:3.5-4.5，磷酸盐缓冲溶液的浓度为8-12mM。

对本发明而言，上述核酸适体-核酸适体夹心法中，划膜液包含TBST缓冲液、牛血清白蛋白（BSA）、蔗糖、海藻糖和异丙醇；上述划膜液中，牛血清白蛋白浓度为1-4wt%；蔗糖浓度为2-20wt%；海藻糖浓度为5-20wt%；异丙醇浓度为0.1-1wt%，余量为TBST缓冲液。

对本发明而言，上述TBST缓冲液包含三羟甲基氨基甲烷（Tris）、氯化钠（NaCl）和吐温-20（Tween-20）；上述TBST缓冲液中，Tris浓度为8-12mM，NaCl浓度为145-155mM，Tween-20含量占TBST缓冲液总体积的0.045-0.055%；TBST缓冲液pH为7.4-7.7（采用盐酸进行调节）。

对本发明而言，上述核酸适体-核酸适体夹心法中，交联产物与划膜液的体积比为：1:0.3-0.4。

本发明还公开了上述的试剂盒是基于核酸适体的膀胱癌标志物蛋白检测的试剂盒。

对本发明而言，上述样品垫为改性玻璃纤维膜。

本发明还公开了一种改性玻璃纤维膜制备方法，包括：采用环氧氯丙烷与玻璃纤维膜发生取代反应，再与4-氨基-3-异丙基-1,2,4-三唑啉-5-酮发生开环反应，制得改性玻璃纤维膜。

本发明提供了一种改性玻璃纤维膜制备方法，将玻璃纤维膜浸入到环氧氯丙烷溶液中，进行取代反应，然后采用4-氨基-3-异丙基-1,2,4-三唑啉-5-酮与接枝在玻璃纤维膜表面的环氧基团发生开环反应，制得的改性玻璃纤维膜用于基于核酸适体的膀胱癌标志物蛋白检测试剂盒的制备，使得制备的试剂盒具有良好的灵敏度。

具体地，上述改性玻璃纤维膜制备方法，包括以下步骤：

将玻璃纤维膜浸入硫酸溶液和过氧化氢溶液的混合液中，在90-95℃处理1-1.5h，去离子水洗涤至中性，干燥，获得活化玻璃纤维膜；然后在环氧氯丙烷中加入氢氧化钠溶液，搅拌混合均匀后，再将活化玻璃纤维膜浸入到其中，在23-30℃处理10-15h，乙醇洗涤3-5次，去离子水洗涤3-5次，干燥，然后浸入到4-氨基-3-异丙基-1,2,4-三唑啉-5-酮的乙醇溶液中，在78-85℃反应20-30h，乙醇洗涤3-5次，去离子水洗涤3-5次，干燥，获得改性玻璃纤维膜。

对本发明而言，上述硫酸溶液与过氧化氢溶液的体积比为：1:0.35-0.42。

对本发明而言，上述环氧氯丙烷与氢氧化钠溶液的体积比为：1:1.8-2.3。

对本发明而言，上述氢氧化钠溶液的浓度为1.2-1.8mol/L。

对本发明而言，上述4-氨基-3-异丙基-1,2,4-三唑啉-5-酮的乙醇溶液中，4-氨基-3-异丙基-1,2,4-三唑啉-5-酮与乙醇的质量体积比为：1g:45-60mL。

本发明还公开了上述改性玻璃纤维膜在膀胱癌标志物蛋白检测中的用途。

为进一步提升膀胱癌标志物蛋白检测试剂盒的性能，本发明还对硝酸纤维素膜进行改性处理。

本发明还公开了一种改性硝酸纤维素膜的制备方法，包括：采用丙烯基脲与硝酸纤维素膜发生接枝反应，制得改性硝酸纤维素膜。

本发明提供了一种改性硝酸纤维素膜的制备方法，以丙烯基脲为改性剂，接枝改性硝酸纤维素膜，然后将制得的改性硝酸纤维素膜用于核酸适体的膀胱癌标志物蛋白检测试剂盒的制备，使得制备的试剂盒具有良好的灵敏度。

具体地，上述改性硝酸纤维素膜的制备方法，包括以下步骤：

在浓度为1-1.5wt%的硝酸溶液中加入硝酸铈铵，搅拌混合均匀后，加入硝酸纤维素膜，氮气氛围下，搅拌15-30min，然后加入丙烯基脲，在70-85℃反应40-70min，取出硝酸纤维素膜，去离子水洗涤3-5次，然后采用浓度为1-1.5wt%的碳酸钠溶液中和，再用去离子水洗涤至中性，干燥，获得改性硝酸纤维素膜。

对本发明而言，上述硝酸铈铵的用量为15-18mmol/L。

对本发明而言，上述硝酸纤维素膜与硝酸溶液的质量体积比为：1g:100-150mL。

对本发明而言，上述硝酸纤维素膜与丙烯基脲的质量比为：1:1-1.5。

本发明还公开了上述制备方法制得的改性硝酸纤维素膜在膀胱癌标志物蛋白检测中的用途。

本发明的有益效果包括：

本发明获得了基于核酸适体的膀胱癌标志物蛋白检测试剂盒，通过对NMP22进行核酸适体-抗体夹心或核酸适体-核酸适体夹心识别的方式制备侧向层析试纸条，实现对尿液标本中NMP22的测定，且在试纸条制备过程中采用4-氨基-3-异丙基-1,2,4-三唑啉-5-酮改性玻璃纤维膜，制得的试纸条具有较高的灵敏性。

因此，本发明提供了基于核酸适体的膀胱癌标志物蛋白检测试剂盒，本发明利用基于NMP22蛋白的指数富集的核酸适体系统进化技术所获得两条识别不同位点的核酸适体，通过对NMP22进行核酸适体-抗体夹心或核酸适体-核酸适体夹心识别的方式制备侧向层析试纸条，实现对尿液标本中NMP22的测定。

附图说明

图1为实施例5制备的改性玻璃纤维膜及玻璃纤维膜的红外谱图测试结果；

图2为实施例6制备的改性硝酸纤维素膜及硝酸纤维素膜的红外谱图测试结果；

图3为实施例2制得的试纸条的不同浓度NMP22抗原测试结果；

图4为实施例4制得的试纸条的不同浓度NMP22抗原测试结果；

图5为实施例2制得的试剂盒对病人尿液与正常人尿液中NMP22含量的测试结果；

图6为实施例4制得的试剂盒对病人尿液与正常人尿液中NMP22含量的测试结果；

图7为实施例2及实施例4制得的试剂盒与市售试剂盒的灵敏度比较结果（患者1是实施例4制得的试剂盒与市售雅培试剂盒的对比，患者2为实施例2制得的试剂盒与市售雅培试剂盒的对比）；

图8为实施例3、实施例5-7制备的试纸条的信噪比测试结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明确，以下结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细描述：

实施例1：

一种乳胶颗粒标记法，包括：

将6.7µL链霉亲和素修饰的乳胶颗粒（购自西安齐岳生物科技有限公司）用三蒸水稀释至20µL，然后加入5µL浓度为100µM的生物素修饰的核酸适体液（生物素修饰的核酸适体液购自生工生物工程（上海）股份有限公司；核酸适体为SEQ ID NO1，购自生工生物工程（上海）股份有限公司）进行偶联，室温震荡1h，然后在4℃，10000rpm条件下离心10min，三蒸水洗涤2次，加入点胶液重悬至终体积20µL，获得乳胶颗粒标记的核酸适体，并储存于4℃。

其中，点胶液包含：Tris-HCl、PEG、Tween-20、蔗糖、海藻糖和BSA。上述点胶液中，PEG含量为0.5wt%；Tween-20含量为2wt%；蔗糖含量为20wt%；海藻糖含量为5wt%；BSA含量为5wt%，余量为Tris-HCl；Tris-HCl的pH为8；PEG分子量为20000Da。

一种试剂盒的制备方法，包括：

步骤一、将乳胶颗粒标记的核酸适体通过划膜机喷涂于结合垫处理液处理好的结合垫（购自杭州艾策生物技术有限公司）上，喷量设置为2µL/cm；

步骤二、在硝酸纤维素膜上进行划膜，划膜速度为1µL/cm；划膜的检测线（T线）使用的抗体为NMP22抗体1B8（购买自武汉戴安生物技术有限公司），浓度为2mg/mL；质控线（C线）抗体选择的抗FITC抗体（购自北京义翘神州科技股份有限公司），划膜浓度为0.5mg/mL；

步骤三、将经样品垫处理液处理好的玻璃纤维膜样品垫（购自杭州艾策生物技术有限公司）、喷涂后的结合垫、划膜后的硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴到PVC底板上，两两相邻粘贴物之间有重叠1.5mm；然后将其切割，获得试纸条，再经组装，获得试剂盒。

其中，样品垫厚度为：0.4±0.05mm；结合垫厚度为：0.2±0.05mm；硝酸纤维素膜厚度为：235±40µm；吸水纸厚度为：0.68±0.08mm。

实施例2：

一种试剂盒的制备方法与实施例1的区别：采用胶体金颗粒标记的核酸适体替代乳胶颗粒标记的核酸适体。

一种胶体金颗粒标记法，包括：

在胶体金（买自郑州凌思生物科技有限公司）中加入三蒸水，至浓度为2.97nM，获得胶体金稀释液100µL，然后加入3µL浓度为100µM的巯基及FITC双修饰的核酸适体液（巯基及FITC双修饰的核酸适体液购自生工生物工程（上海）股份有限公司；核酸适体为SEQ IDNO2，购自生工生物工程（上海）股份有限公司），在-20℃冷冻处理2h，然后在4℃，8000rpm条件下离心6min，三蒸水洗涤2次，加入胶体金复溶液（购自杭州艾策生物技术有限公司）重悬，重悬至终体积24µL，获得胶体金颗粒标记的核酸适体，并储存于4℃。

实施例3：

一种试剂盒的制备方法与实施例1的区别：采用荧光量子点标记的核酸适体替代乳胶颗粒标记的核酸适体。

一种荧光量子点标记法，包括：

在6.67µL浓度为1mg/mL的链霉亲和素修饰的量子点微球液（购自武汉珈源量子点技术开发有限公司）中加入5µL浓度为100µM生物素修饰的核酸适体液（生物素修饰的核酸适体液购自生工生物工程（上海）股份有限公司；核酸适体为SEQ ID NO1，购自生工生物工程（上海）股份有限公司），室温条件下震荡处理1h，然后在4℃，10000rpm条件下离心10min，三蒸水洗涤2次，加入点胶液重悬至终体积20µL，获得荧光量子点标记的核酸适体，并储存于4℃。

点胶液配方同实施例1。

实施例4：

一种试剂盒的制备方法与实施例2的区别：步骤二不同。

步骤二包括：在硝酸纤维素膜上进行划膜，划膜速度为1µL/cm；将生物素修饰的核酸适体液（生物素修饰的核酸适体液购自生工生物工程（上海）股份有限公司；核酸适体为SEQ ID NO2，购自生工生物工程（上海）股份有限公司）和链霉亲和素（购自索莱宝生物科技有限公司）按体积比4:1在磷酸盐缓冲溶液DPBS中室温反应30min，反应完成后，使用30KD超滤管去除未结合到SA上的核酸适体，将得到的交联产物用划膜液按照体积比3:1进行稀释，即得到检测线划膜溶液；C线抗体选择的抗FITC抗体（购自北京义翘神州科技股份有限公司），划膜浓度为0.5mg/mL。

其中，

磷酸盐缓冲溶液的浓度为10mM；

划膜液包含TBST缓冲液、牛血清白蛋白（BSA）、蔗糖、海藻糖和异丙醇；上述划膜液中，牛血清白蛋白浓度为2wt%；蔗糖浓度为10wt%；海藻糖浓度为10wt%；异丙醇浓度为0.5wt%，余量为TBST缓冲液。

TBST缓冲液包含三羟甲基氨基甲烷（Tris）、氯化钠（NaCl）、吐温-20（Tween-20）；上述TBST缓冲液中，Tris浓度为10mM，NaCl浓度为150mM，Tween-20含量占TBST缓冲液总体积的0.05%；TBST缓冲液pH为7.5（采用盐酸进行调节）。

实施例5：

一种试剂盒的制备方法与实施例3的区别：采用改性玻璃纤维膜替代玻璃纤维膜。

改性玻璃纤维膜制备方法，包括以下步骤：

将玻璃纤维膜浸入硫酸溶液和过氧化氢溶液的混合液中，在90℃处理1.5h，去离子水洗涤至中性，干燥，获得活化玻璃纤维膜；然后在环氧氯丙烷中加入氢氧化钠溶液，搅拌混合均匀后，再将活化玻璃纤维膜浸入到其中，在23℃处理15h，乙醇洗涤3次，去离子水洗涤3次，干燥，然后浸入到4-氨基-3-异丙基-1,2,4-三唑啉-5-酮的乙醇溶液中，在78℃反应30h，乙醇洗涤3次，去离子水洗涤3次，干燥，获得改性玻璃纤维膜。

其中，硫酸溶液与过氧化氢溶液的体积比为：1:0.35，硫酸溶液的浓度为95wt%，过氧化氢溶液的浓度为30wt%；上述环氧氯丙烷与氢氧化钠溶液的体积比为：1:1.8；氢氧化钠溶液的浓度为1.2mol/L；4-氨基-3-异丙基-1,2,4-三唑啉-5-酮的乙醇溶液中，4-氨基-3-异丙基-1,2,4-三唑啉-5-酮与乙醇的质量体积比为：1g:45mL。

实施例6：

一种试剂盒的制备方法与实施例3的区别：采用改性硝酸纤维素膜替代硝酸纤维素膜。

改性硝酸纤维素膜的制备方法，包括以下步骤：

在浓度为1wt%的硝酸溶液中加入硝酸铈铵，搅拌混合均匀后，加入硝酸纤维素膜，氮气氛围下，搅拌15min，然后加入丙烯基脲，在70℃反应70min，取出硝酸纤维素膜，去离子水洗涤3次，然后采用浓度为1wt%的碳酸钠溶液中和，再用去离子水洗涤至中性，干燥，获得改性硝酸纤维素膜。

其中，硝酸铈铵的用量为15mmol/L；硝酸纤维素膜与硝酸溶液的质量体积比为：1g:100mL；硝酸纤维素膜与丙烯基脲的质量比为：1:1。

实施例7：

一种试剂盒的制备方法与实施例5的区别：采用改性硝酸纤维素膜替代硝酸纤维素膜。

改性硝酸纤维素膜的制备方法与实施例6相同。

试验例：

1.红外光谱测试

采用傅里叶红外光谱仪进行红外光谱测试。

对实施例5制备的改性玻璃纤维膜及玻璃纤维膜进行上述测试，结果如图1所示，由图1可知，与玻璃纤维膜的红外谱图相比，改性玻璃纤维膜的红外谱图在3492cm

对实施例6制备的改性硝酸纤维素膜及硝酸纤维素膜进行上述测试，结果如图2所示，由图2可知，与硝酸纤维素膜的红外谱图相比，改性硝酸纤维素膜的红外谱图在1117cm

2.侧向层析试纸条测定NMP22重组抗原

通过滴加含不同浓度的含NMP22重组缓冲液（含NMP22重组缓冲液中包含Tris-HCl、聚乙烯吡咯烷酮、PEG和BSA；其中，Tris-HCl浓度为0.5M，聚乙烯吡咯烷酮浓度为1wt%，PEG浓度为1wt%，BSA浓度为3wt%），观察检测NMP22试纸条出现条带的情况：

用胶头滴管吸取上述尿液，滴3滴在样品垫上，滴加后静置15min后进行结果判读：

阳性(+)：出现两条带，检测线和质控线，表示样本中存在膀胱癌蛋白标志物NMP22；

阴性(-)：仅质控线出现一条带，检测线无条带出现，表示样本中没有膀胱癌蛋白标志物NMP22；

无效：质控线未出现红色条带，可能是由于不正确的操作或试剂已失效，应重新测试。

对实施例2、实施例4制得的试纸条进行上述测试，结果如图3、图4所示。由图3和图4可见检测效果良好，说明本发明筛选的核酸适体能够有效检测出环境中的膀胱癌蛋白标志物NMP22。

3.用于测定NMP22试剂盒的样本检测临床应用情况

随机选择4例膀胱癌病人及4例健康人的尿液样本进行检测，用胶头滴管吸取上述尿液，滴3滴在NMP22试剂盒样品垫上，滴加后静置15min后进行结果判读，判读方法同试验例2，观察检测膀胱癌试纸条出现条带的情况。

对实施例2、实施例4制得的试剂盒进行上述测试，结果如图5、图6所示。由图5和图6均可见检测效果良好，且灵敏度优于市售基于双抗体夹心法的膀胱癌辅助诊断试剂盒（图7），说明本发明所构建的核酸适体试纸条能够有效检测出尿液中的膀胱癌蛋白标志物NMP22。

4.灵敏度测试

通过滴加10μg/mL的含NMP22重组缓冲液（含NMP22重组缓冲液中包含Tris-HCl、聚乙烯吡咯烷酮、PEG和BSA；其中，Tris-HCl浓度为0.5M，聚乙烯吡咯烷酮浓度为1wt%，PEG浓度为1wt%，BSA浓度为3wt%），以滴加0μg/mL为对比，观察检测NMP22试纸条，采用荧光免疫分析仪检测出T值和C值，并按照T/C的强度值做均值，记录信噪比；信噪比计算公式如下：

S=R1/R0

其中，S为信噪比；R1为采用10μg/mL的含NMP22重组缓冲液时T/C的均值；R1为采用0μg/mL的含NMP22重组缓冲液时T/C的均值。

对实施例3、实施例5-7制备的试纸条进行上述测试，结果如图8所示。由图8可知，实施例5与实施例3、实施例7与实施例6相比，信噪比有所增加，说明采用4-氨基-3-异丙基-1,2,4-三唑啉-5-酮改性玻璃纤维膜，然后用于试纸条的制备，使得试纸条具有良好的灵敏度；实施例6与实施例3、实施例7与实施例5相比，信噪比明显增加，说明采用丙烯基脲改性硝酸纤维素膜，然后用于试纸条的制备，也使得试纸条具有良好的灵敏度。

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。