一种新型的核酸适配体试纸条检测甲胎蛋白

技术领域

本发明涉及甲胎蛋白检测技术领域，具体为一种新型的核酸适配体试纸条检测甲胎蛋白。

背景技术

肝细胞癌是世界上最常见的十大癌症之一，通常是肝硬化患者死亡的主要原因，目前大多数临床技术，如影像学和组织学等，只能在晚期肝癌中发挥作用，血清肿瘤生物标志物检测技术可以更准确地诊断相关肿瘤，甲胎蛋白(AFP)作为肝癌诊断中最常用的蛋白生物标志物，近年来备受关注，AFP通常由胎儿的卵黄囊产生，是7-8月龄时由肝脏分泌的一种血浆蛋白，随着胎儿的出生和发育，其含量逐渐减少，健康人血清中AFP浓度小于25ng/mL，然而，在近75％的HCC患者中，AFP浓度显著升高至500ng/mL，成人血液中高水平的AFP可能表明某些类型癌症的存在，特别是肝癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌或睾丸癌。

近年来，基于侧向层析生物传感器的甲胎蛋白检测方法得到了广泛的关注和应用，例如公告号为CN110398585B的中国发明专利，该发明公开了一种测定甲胎蛋白抗原的免疫生物传感器及其制备方法与应用，所述的测定甲胎蛋白抗原的免疫生物传感器，其基底电极表面依次经过羧基化多壁碳纳米管、乙烯基二茂铁-N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯电聚合和甲胎蛋白抗原抗体修饰即得，与现有技术相比，该发明具有如下优点：(1)MWCNTs具有比表面积大、吸附力强、导电性能好等优点；(2)制备的电化学免疫传感器具有灵敏度高，反应时间短，组装简单，信号强，线性范围宽等优点，并实现了对肿瘤标志物AFP的痕量检测；(3)该传构建方法也可用于其他免疫蛋白或致病抗原物质的测定，在临床方面有广泛的应用价值；(4)该发明的免疫生物传感器操作简单，成本低。

然而，AFP侧流式试纸条均基于抗体-抗原-抗体免疫反应的双抗体夹心法检测原理，抗体的不稳定性和操作复杂性，导致了高成本且低效率，在这方面，一种能够识别多种靶标(包括寡核苷酸、蛋白质、小分子，甚至外泌体和整个细胞)的适体已经出现，并被广泛用于开发用于早期监测各种癌症生物标志物的生物传感器。

核酸适配体是利用指数富集配体的系统进化技术，从人工构建的寡核苷酸文库中筛选得到的一类对靶目标有高度亲和力和严格特异性的寡核苷酸分子，该适配体具有灵活、可重复、易于固定和再生和批次间无差异等特点，已广泛应用于传感器领域，已报道的基于适配体的甲胎蛋白检测方法包括:拉曼光谱法、双偏振干涉法、共振光散射法、荧光法、化学发光法、循环伏安法、电化学阻抗法和巨磁阻抗法，用于AFP检测的光学适配体生物传感器具有最宽的线性检测范围，用于AFP检测的电化学适配体生物传感器具有最低的LOD，基于荧光的传感器通常比其他传感器更简单，成本更低，而电化学传感器的测量结果总是受到环境条件的影响，故而提供一种新型的核酸适配体试纸条检测甲胎蛋白以解决上述问题。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种新型的核酸适配体试纸条检测甲胎蛋白，具备测量结果不受到环境条件影响等优点，解决了电化学传感器的测量结果总是受到环境条件影响的问题。

(二)技术方案

第一方面，为实现上述测量结果不受到环境条件影响目的，本发明提供如下技术方案：一种新型的核酸适配体试纸条检测甲胎蛋白，其包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫。

优选的，所述硝酸纤维素膜的内部固定有检测线和质控线，所述结合垫的外表面喷涂有核酸适配体偶联物。

优选的，所述检测线的外表面喷涂有捕获探针溶液，所述质控线的外表面喷涂有质控探针溶液。

优选的，所述捕获探针溶液包括链霉亲和素和捕获探针，所述质控探针溶液包括链霉亲和素和质控探针。

优选的，所述核酸适配体偶联物包括有检测探针和胶体金，所述检测探针的碱基序列为SH-GTGACGCTCCTAACGCTGACTCAGGTGCAGTTCTCGACTCGGTCTTGATGTGGGTCCTGTCCGTCCGAACCAATC。

优选的，所述捕获探针序列为Bi ot i n-GTGACGCTCCTAACGCTGACTCAGGTGCAG TTCTCGACTCGGTCTTGATGTGGGTCCTGTCCGTCCGAACCAATC，所述质控探针DNA序列为Bi ot i n-GATTGGTTCGGACG。

优选的，所述底板为PVC安装板，所述硝酸纤维素膜为JN140、VIVID和CN140中的一种。

第二方面，为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种新型的核酸适配体试纸条检测甲胎蛋白的制备方法，应用在上述新型的核酸适配体试纸条检测甲胎蛋白，包括以下步骤：

1)将100mLHAuC l

2)将50μL的步骤1)中的胶体金与4μL的核酸适配体检测探针混匀，将其加入700μL丁醇中，使其完全脱水，待完全脱水后，得到初代混合物；

3)向步骤2)中的初代混合物内加入50μL的ddH

4)向步骤3)中的离心混合物内加入1μL的MCH溶液，之后离心洗涤2次，在最后一次离心结束后将其重悬在50μL-110μL的重悬缓冲液中，得到核酸适配体偶联物，最后将核酸适配体偶联物液置于4℃的环境下以便后续使用；

5)将捕获探针与1mg/mL的链霉亲和素混合得到浓度为30-60μmo l/L的捕获探针溶液，将质控探针与1mg/mL的链霉亲和素混合得到浓度为30-60μmo l/L的质控探针溶液；

6)在结合垫上喷涂步骤4)中的核酸适配体偶联物，喷涂量为4-7μL/cm，得到结合垫试纸条；

7)在硝酸纤维素膜上的检测线和质控线上分别喷涂步骤5)中的捕获探针溶液和质控探针溶液，喷涂量为0.5-2.0μL/cm，并使其干燥，得到免疫层析试纸条；

8)将步骤7)中的免疫层析试纸条与底板粘贴固定后，依次固定步骤6)中的结合垫试纸条、样品垫和吸收垫，得到试纸条；

9)最后将将步骤8)中的试纸条扣入卡壳中，即可得到新型的核酸适配体试纸条。

优选的，所述重悬缓冲液分构成包括：400-600mg的蔗糖、30-40mg的Na

(三)有益效果

与现有技术相比，本发明提供了一种新型的核酸适配体试纸条检测甲胎蛋白，具备以下有益效果：

该新型的核酸适配体试纸条检测甲胎蛋白，将目标物甲胎蛋白抗原加入核酸适配体试纸条内部，当甲胎蛋白抗原通过层析作用经过结合垫上时，会与金标适配体结合形成AFP抗原-金标适配体偶联物，从而在经过检测区时，会被AFP适配体的捕获探针捕获，出现红色条带，而多余的金标适配体偶联物继续层析到核酸适配体试纸条内的质控线区处，质控线处是与核酸适配体检测探针互补的一段DNA序列，因此在质控线出现红色条带，经试验，核酸适配体试纸条用肉眼能够检测甲胎蛋白的最低浓度为10ng/mL，使得测量结果不受到环境条件影响。

附图说明

图1为本发明提出的一种新型的核酸适配体试纸条检测甲胎蛋白结构示意图；

图2为本发明提出的一种新型的核酸适配体试纸条检测甲胎蛋白实施例1-5效果对比图；

图3为本发明提出的一种新型的核酸适配体试纸条检测甲胎蛋白的甲胎蛋白特异性图；

图4为本发明提出的一种新型的核酸适配体试纸条检测甲胎蛋白检测甲胎蛋白的效果图。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

甲胎蛋白(AFP)是一种糖蛋白，它属于白蛋白家族，主要由胎儿肝细胞及卵黄囊合成，甲胎蛋白在胎儿血液循环中具有较高的浓度，出生后则下降，至生后2～3月甲胎蛋白基本被白蛋白替代，血液中较难检出，故在成人血清中含量极低。

核酸适配体是一种经体外筛选技术-指数富集的配体系统进化技术，得到的结构化的寡核苷酸序列(RNA或DNA)，与相应的靶标分子(蛋白质，病毒，细菌，细胞，重金属离子等)有严格的识别能力和高度的亲和力。

第一方面，为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种新型的核酸适配体试纸条检测甲胎蛋白，其包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫。

作为本申请的一种实施方式，硝酸纤维素膜的内部固定有检测线和质控线，结合垫的外表面喷涂有核酸适配体偶联物。

需要说明的是，检测线是用于检测待测样本中目标物的线，通过在检测线上固定化目标物的特异性抗体或核酸，当样本中存在该目标物时，它会与检测线上的特异性抗体或核酸结合，形成复合物，而质控线是用于验证试剂盒的可靠性和操作的正确性的参考线，通常会添加一个已知目标物，并与标准参考物结合。

作为本申请的一种实施方式，检测线的外表面喷涂有捕获探针溶液，质控线的外表面喷涂有质控探针溶液。

作为本申请的一种实施方式，捕获探针溶液包括链霉亲和素和捕获探针，质控探针溶液包括链霉亲和素和质控探针。

需要补充的是，链霉亲和素是与亲和素有相似生物学特性的一种蛋白质，是streptomyces-avi d i n ii菌的分泌物，其分子量及结合生物素的能力与鸡蛋清中的亲和素相似，等电点6.0，非特异性结合远比亲和素低，可以用于水溶液中蛋白质和小配体的非共价结合。

作为本申请的一种实施方式，核酸适配体偶联物包括有检测探针和胶体金，检测探针的碱基序列为SH-GTGACGCTCCTAACGCTGACTCAGGTGCAGTTCTCGACT CGGTCTTGATGTGGGTCCTGTCCGTCCGAACCAATC。

作为本申请的一种实施方式，捕获探针序列为Bi ot i n-GTGACGCTCCTAACGC TGACTCAGGTGCAGTTCTCGACTCGGTCTTGATGTGGGTCCTGTCCGTCCGAACCAATC，质控探针DNA序列为Biot i n-GATTGGTTCGGACG。

作为本申请的一种实施方式，底板为PVC安装板，硝酸纤维素膜为JN140、VIVID和CN140中的一种。

需要说明的是，PVC即聚氯乙烯，它是世界上产量最大的塑料产品之一，价格便宜，根据不同的用途可以加入不同的添加剂，聚氯乙烯塑料可呈现不同的物理性能和力学性能，在聚氯乙烯树脂中加入适量的增塑剂，可制成多种硬质、软质和透明制品。

第二方面，本申请又提出一种新型的核酸适配体试纸条检测甲胎蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1)将100mLHAuCl

2)将50μL的步骤1)中的胶体金与4μL的核酸适配体检测探针混匀，胶体金具有高电子密度、介电特性和催化作用，能与多种生物大分子结合，且不影响其生物活性，将其加入700μL丁醇中，使其完全脱水，待完全脱水后，得到初代混合物。

3)向步骤2)中的初代混合物内加入50μL的ddH

4)向步骤3)中的离心混合物内加入1μL的MCH溶液，之后离心洗涤2次，在最后一次离心结束后将其重悬在50μL-110μL的重悬缓冲液中，得到核酸适配体偶联物，最后将核酸适配体偶联物液置于4℃的环境下以便后续使用。

5)将捕获探针与1mg/mL的链霉亲和素混合得到浓度为30-60μmol/L的捕获探针溶液，将质控探针与1mg/mL的链霉亲和素混合得到浓度为30-60μmo l/L的质控探针溶液。

6)在结合垫上喷涂步骤4)中的核酸适配体偶联物，喷涂量为4-7μL/cm，得到结合垫试纸条。

7)在硝酸纤维素膜上的检测线和质控线上分别喷涂步骤5)中的捕获探针溶液和质控探针溶液，喷涂量为0.5-2.0μL/cm，并使其干燥，得到免疫层析试纸条。

8)将步骤7)中的免疫层析试纸条与底板粘贴固定后，依次固定步骤6)中的结合垫试纸条、样品垫和吸收垫，得到试纸条。

9)最后将将步骤8)中的试纸条扣入卡壳中，即可得到新型的核酸适配体试纸条。

作为本申请的一种实施方式，重悬缓冲液分构成包括：400-600mg的蔗糖、30-40mg的Na

实施例一：

本实例提供一种新型的核酸适配体试纸条检测甲胎蛋白，以配比数计，重悬缓冲液成分构成配比：500mg的蔗糖、20mg的Na

一种新型的核酸适配体试纸条检测甲胎蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1)将100mLHAuC l

2)将50μL的步骤1)中的胶体金与4μL的核酸适配体检测探针混匀，将其加入700μL丁醇中，使其完全脱水，待完全脱水后，得到初代混合物；

3)向步骤2)中的初代混合物内加入50μL的ddH

4)向步骤3)中的离心混合物内加入1μL的MCH溶液，之后离心洗涤2次，在最后一次离心结束后将其重悬在100μL的重悬缓冲液中，得到核酸适配体偶联物，最后将核酸适配体偶联物液置于4℃的环境下以便后续使用；

5)将捕获探针与1mg/mL的链霉亲和素混合得到浓度为35μmo l/L的捕获探针溶液，将质控探针与1mg/mL的链霉亲和素混合得到浓度为35μmo l/L的质控探针溶液；

6)在结合垫上喷涂步骤4)中的核酸适配体偶联物，喷涂量为6μL/cm，得到结合垫试纸条；

7)在硝酸纤维素膜上的检测线和质控线上分别喷涂步骤5)中的捕获探针溶液和质控探针溶液，喷涂量为1μL/cm，并使其干燥，得到免疫层析试纸条；

8)将步骤7)中的免疫层析试纸条与底板粘贴固定后，依次固定步骤6)中的结合垫试纸条、样品垫和吸收垫，得到试纸条；

9)最后将将步骤8)中的试纸条扣入卡壳中，即可得到新型的核酸适配体试纸条。

本实施例中，新型核酸试纸条产品进行实验验证试纸条的特异性，由图3可以看出试纸条可以特异性地检测到甲胎蛋白，即使在高浓度的其他目标物存在下也不会对甲胎蛋白的检测产生影响。

实施例二：

与实施例1的区别仅在于：检测探针的体积为2μL，硝化纤维素膜为JN140、捕获探针的浓度为0.5μL/cm、重悬缓冲液的体积为50μL。

实施例三：

与实施例1的区别仅在于：检测探针的体积为3μL，硝化纤维素膜为VIVID、捕获探针的浓度为1.0μL/cm、重悬缓冲液的体积为70μL。

实施例四：

与实施例1的区别仅在于：检测探针的体积为4μL，硝化纤维素膜为CN140、捕获探针的浓度为1.5μL/cm、重悬缓冲液的体积为90μL。

实施例五：

与实施例1的区别仅在于：检测探针的体积为5μL，硝化纤维素膜为CN140、捕获探针的浓度为2.0μL/cm、重悬缓冲液的体积为110μL。

根据实施例1-5来看，从图2可以看出试纸条制备的最佳条件：胶体金偶联的检测探针体积的最佳优化结果是4μL，硝化纤维素膜种类最佳是VI VID，检测线上捕获探针浓度的最佳优化结果是1.5μL/cm，重悬缓冲液体积最佳优化结果是50μL。

实验例：

实验方法：

在实施例2制备的新型核酸试纸条产品的样品检测窗口中滴加含有不同浓度目标物的50μL缓冲液，检测液向吸收垫迁移，在15min后对测试和控制区进行目视评估，检测结果见图3，并且由图4可以看出，在没有仪器的情况下，本发明的新型核酸试纸条检测甲胎蛋白的肉眼检出限为10ng/mL。

本发明的有益效果是：将目标物甲胎蛋白抗原加入核酸适配体试纸条内部，当甲胎蛋白抗原通过层析作用经过结合垫上时，会与金标适配体结合形成AFP抗原-金标适配体偶联物，从而在经过检测区时，会被AFP适配体的捕获探针捕获，出现红色条带，而多余的金标适配体偶联物继续层析到核酸适配体试纸条内的质控线区处，质控线处是与核酸适配体检测探针互补的一段DNA序列，因此在质控线出现红色条带，经试验，核酸适配体试纸条用肉眼能够检测甲胎蛋白的最低浓度为10ng/mL，使得测量结果不受到环境条件影响。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。