一种用于无创筛查早期肿瘤的检测方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及精准医疗技术领域，尤其是指一种用于无创筛查早期肿瘤的检测方法和试剂盒。

背景技术

肿瘤早筛是指对尚无肿瘤症状的人群进行医学检查，从而发现早期肿瘤。早发现、早治疗是提高恶性肿瘤治疗率和预后的关键。肿瘤早期发现的难点在于肿瘤的异质性，目前还没有一个完美的标志物，可以代表所有肿瘤。同时检测成本也极大影响了早期筛查的可及性。PD-L1(Programmed Death-Ligand 1)，也称为CD274，是一种免疫检查点蛋白，在多种肿瘤细胞和免疫细胞表面表达。它与T细胞表面的PD-1受体结合，抑制T细胞的抗肿瘤免疫反应。PD-L1与T细胞表面的PD-1受体结合后，会抑制T细胞的增殖、细胞因子产生和细胞毒性活性。这导致T细胞无法有效杀伤肿瘤细胞，从而促进肿瘤的发生和发展。PD-L1还可以与肿瘤细胞表面的PD-1受体结合，促进肿瘤细胞的增殖和迁移，这进一步促进肿瘤的生长和转移。多种肿瘤细胞表达PD-L1，包括肺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌、卵巢癌等。PD-L1的表达水平与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移密切相关。多种肿瘤细胞可以通过外泌体形式释放PD-L1进入血浆，研究发现患者血浆外泌体PD-L1水平升高。血浆中肿瘤释放的外泌体相关PD-L1是一种新型的泛癌种肿瘤早期筛查标志物。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用于无创筛查早期肿瘤的检测方法和试剂盒，只检测与EpCAM共定位的PD-L1含量，不需要大型检测设备，灵敏度高，成本低廉。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种用于无创筛查早期肿瘤的检测方法，包括以下步骤：

S1，分离受试者血浆，孵育，使适配体与外泌体表面蛋白相结合；

S2，富集外泌体；

S3，催化连接反应，制作模板进行ddPCR检测。

优选地，步骤S1中孵育的适配体为：生物素化的CD63适配体、叠氮修饰EpCAM适配体及炔烃修饰的PD-L1适配体；所述适配体使用SELEX技术筛选获得。

优选地，所述CD63适配体包括以下三种序列：

适配体ACD63-01，序列为：

ATCGTAATCACACTGCCCTCGCTCCAGCCCAC-C6-biotin；

适配体ACD63-04，序列为：

AGTCGTCCGACAGTCCCATGCTGGAGGCATGCAGACAGGACTAT-C6-biotin；

适配体ACD63-05，序列为：

TGTAATTAGCATTACTCTCTCGGGTGCGAGCTGGGTGGTA-C6-biotin。

优选地，所述EpCAM适配体为AEM-02，序列为：

CTCCAGTAGGCGGGTAGTCTAGCAGCCTGACTGCATTGCAGTCACTAAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-AZ。

优选地，所述PD-L1适配体为APD-05，序列为：

Hexynyl-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTAACGCGTATCATAGATTCGTTCTCTAGTCGTTAGTAGAATGTCAGTTGT。

优选地，所述ddPCR引物及探针如下：

Primer-F，序列为：GTCACTAAATGATACGGCGACC；

Primer-R，序列为：CGCGTTACAATCTCGTATGCC；

Probe，序列为：FAM-CTTCTGCTTGGTGTAGATCTCGGT-BHQ1。

优选地，步骤S2中富集外泌体的具体方法为：用链霉亲和素磁珠捕获带生物素的CD63适配体，富集外泌体的同时，洗去未结合的适配体。

应用上述任意一项所述的一种用于无创筛查早期肿瘤的检测方法的试剂盒，应用本检测方法的试剂盒。

本发明的有益效果：

1、通常血浆PD-L1检测的是血液中所有细胞释放的PD-L1，与肿瘤发生相关度较低；本发明只检测与EpCAM共定位的PD-L1含量，更能反映肿瘤发生情况。

2、常规外泌体PD-L1检测需要超高速离心机、酶标仪等大型设备；本发明除ddPCR仪外不需要大型设备。

3、常规血液PD-L1检测，只能做到相对定量，且灵敏度较低；本发明利用ddPCR可以实现PD-L1分子的绝对定量，灵敏度高。

4、常规PD-L1检测依赖抗体，成本较高；本发明基于适配体，合成成本低廉。

附图说明

图1为本发明的适配体纯化外泌体结果；

图2为本发明的ddPCR结果统计。

具体实施方式

为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例与附图对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。

实施例1

使用SELEX技术筛选CD63,EpCAM,PD-L1三种蛋白的适配体，分别得到多条适配体序列，分别选择亲和力最高的适配体进行后续实验。

其中CD63适配体有3种序列，见下表1：

表1适配体序列

提取健康人血浆，分别取1mL血浆，分别加入ACD63-01,ACD63-04，ACD63-05三种适配体及三种适配体混合物，使适配体终浓度为50nM。25℃，孵育1h。然后将孵育后的血浆加入到PBS漂洗过的链霉亲和素磁珠中，1000rpm振荡混匀，10min；然后置于磁力架吸附5min，去除上清，再加入500μL PBS，重复振荡混匀与磁珠清洗步骤，共两遍。然后加入含DNaseⅠ的50μL PBS，吹打混匀后，37℃孵育30min，磁力架吸附5min，使用纳米颗粒追踪分析仪(NTA)统计纯化后外泌总量。可以看出使用三种适配体混合纯化外泌体要多于单独使用其中一种(如图1)。

实施例2

分别提取33例健康人及43例肿瘤患者(其中肺癌22例，肠癌21例)血浆，取1mL血浆，分别加入15nMACD63-01,15nMACD63-04，15nMACD63-05,50nM AEM-02,50nM APD-05五种适配体。25℃，孵育1h。然后将孵育后的血浆加入到PBS漂洗过的链霉亲和素磁珠中，1000rpm振荡混匀，10min；然后置于磁力架吸附5min，去除上清，再加入500μL PBS，重复振荡混匀与磁珠清洗步骤，共两遍。向清洗完毕的磁珠中加入20μL连接buffer(1mM Cu-TBTA，2mM抗坏血酸，1×PBS)，25℃，孵育30min；之后加入180μL PBS，取1μL做为ddPCR模板进行检测。

ddPCR引物及探针如下表2：

表2ddPCR引物及探针

阳性液滴数，即是血浆外泌体上PD-L1含量。对比健康人及肿瘤患者结果，可以看出肿瘤患者血浆外泌体上PD-L1含量明显高于健康人，以阳性液滴数20为阳性判断值，可以很好区分健康人与肿瘤患者，特异性100％，敏感性93％。

本实施例中的所有技术特征均可根据实际需要而进行外观修改。

上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本技术方案构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。