药物组合物

本申请是中国专利申请201480026783.9的分案申请，原申请的申请日是2014年3月14日，名称是“药物组合物”。

相关申请

本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请号61/792,440的权益。将上述申请的全部教导引入本文作为参考。

发明背景

通常期望增强活性剂的药代动力学特性(例如延长药物作用期限或将任何不期望的作用减少至最低限度)。药物、特别是肽药物典型地在体内易溶且可以快速地被吸收，导致可利用的药物骤然增加，与更为逐步释放的药物相反。可以提供更逐步或延长药物释放的组合物可以导致施用后的药物浓度减少波动，增加每次施用的药物载量，提高稳定性和体内和体外效能，降低毒性和因施用频率较低而增加患者的依从性。照此，对于包含活性剂的提供活性剂延长释放的药物组合物存在需求。

发明概述

本发明涉及包含阳离子多肽和选自如下的阴离子赋形剂的离子配合物：PEG-羧酸；具有10或以上个碳原子的脂肪酸；阴离子磷脂；及其组合，它们具有不同的摩尔比。本发明还涉及包含本发明离子配合物和药学上可接受的载体的药物组合物。对于所述配合物的阳离子多肽，与单独的阳离子多肽相比，该离子配合物的阳离子多肽具有药理学活性且所述配合物可以在施用后提供更期望的药代动力学特性，例如作为缓释制剂。

本发明还涉及所述离子配合物和包含它的药物组合物在治疗患有响应于所述离子配合物的阳离子多肽所具有的药理学活性的疾病或障碍的个体中的用途。在一个实施方案中，待治疗的障碍响应于需要治疗的个体的黑皮质素-4受体(MC4R)调节。该方法包括对所述个体施用有效量的包含例如本文式I中所述的那些MC4R调节剂作为阳离子多肽的离子配合物。在一个具体的实施方案中，响应于MC4R调节的障碍包括1型糖尿病、2型糖尿病、肥胖、胰岛素抵抗、代谢综合征、男性勃起功能障碍、女性性功能障碍、非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪性肝炎、物质滥用障碍，包括酒精中毒性进食障碍、恶病质、炎症和焦虑。

在一些实施方案中，本发明的化合物和组合物对MC4R和黑皮质素-3受体(MC3R)具有的选择性和性能高于对黑皮质素-1受体(MC1R)。本发明的化合物和组合物可以减少或消除不期望的副作用，例如血压效应增加、心率增加、对性唤起不期望的作用和皮肤色素沉着增加。

本发明的离子配合物和包含它们的药物组合物可以增强该配合物的阳离子多肽的药代动力学特性。例如，所述阳离子多肽的药理学作用期限可以得到延长，同时显著地缩小在其药代动力学特性中最大与最小药物暴露比例。因此，所述阴离子肽的治疗剂量可以被维持在体内的有益暴露范围内，由此缓解可能因单独的阳离子多肽药物导致的不期望的副作用的可能性。可以提供活性成分更逐步或延长释放的组合物可以导致在施用后活性成分的浓度波动减少，增加每次施用的药物载量，提高稳定性和体内和体外效能，降低毒性和因施用频率较低而增加患者的依从性。本发明的离子配合物组合物适合于在不同组的给药范围内有效地进行治疗施用，包括每日至少1次，每周1次，每隔2周1次，每隔4周1次，每隔2个月1次，每隔3个月1次，每隔4个月1次，每隔5个月1次，或每隔6个月1次。

附图简述

图1是显示药物组合物施用于猕猴后鉴定的各自的药代动力学特性的示意图。

图2是显示药物组合物施用于猕猴后鉴定的各自的药代动力学特性的示意图。

图3是显示药物组合物施用于猕猴后鉴定的各自的药代动力学特性的示意图。

发明详述

本发明实施例实施方案的描述如下。

词汇表

用于定义肽类的命名法是典型地本领域中使用的，其中N-末端上的氨基显示在左侧，而C-末端上的羧基显示在右侧。

本文所用的术语“氨基酸”包括天然存在的氨基酸和非天然的氨基酸。除非另有指示，否则本文所述化合物上的所有氨基酸及其残基均可以为D或L构型。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。将本文举出的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献完整地引入本文作为参考。

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除非另有指示，否则本公开文本中氨基酸的所有缩写(例如Ala)是指氨基酸残基，即表示-NH-C(R)(R′)-CO-的结构，其中R和R′各自独立地是氢或氨基酸侧链(例如对于Ala，R＝CH

多肽末端上的命名“Ac”或“NH

短语“氨基酸侧链之间的共价键”是指所述两个氨基酸残基的侧链各自包括能够彼此形成共价键的官能团。这种键的实例包括Cys、hCys或Pen侧链形成的二硫键和一个氨基酸侧链的氨基和另一个氨基酸侧链的羧基形成的酰胺键，例如Asp、Glu、Lys、Orn、Dbu或Dpr。当在氨基酸侧链之间形成共价键时，多肽可以被环化。这类环多肽可以用一种结构式表示或通过缩略语符号“c()”或“环()”表示。例如，“-c(Cys-Cys)-”或“-环(Cys-Cys)-”表示如下结构：

而“-c(Asp-Lys)-”或“-环(Asp-Lys)-”表示如下结构：

离子配合物

本发明涉及包含阳离子多肽和选自如下的阴离子赋形剂的离子配合物：PEG-羧酸；具有10或以上个碳原子的脂肪酸；磷脂；及其组合。所述离子配合物中所述阳离子多肽与所述阴离子赋形剂的摩尔比可以为，例如，约1∶1-约1∶10，其中该摩尔比基于所述阳离子多肽的电荷与所述阴离子赋形剂的电荷之比。该摩尔比通常选自约1∶1、约1∶2、约1∶3、约1∶4、约1∶5、约1∶6、约1∶7、约1∶8、约1∶9或约1∶10。

阴离子赋形剂

阴离子磷脂：

本文所用的“阴离子磷脂是这样一种磷脂，其中磷酸基团的一个或多个氧原子被脱质子化，产生有机磷酸氧代阴离子和带负电荷的脂质。天然存在的阴离子磷脂类典型地包含C

用于本发明的具体的阴离子磷脂类是1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸氨基乙醇(DSPE)缀合的聚乙二醇，其结构如下：

其中“n”的值随分子量改变。这类阴离子磷脂类在本文中称作mPEG-(Mol.Wt.)DSPE。适合的实例包括mPEG-2,000-DSPE和mPEG-5,000-DSPE，其中DSPE是1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸氨基乙醇。其它实例包括mPEG-2,000-DPPE和mPEG-5,000-DPPE，其中DPPE是1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸氨基乙醇。

还可以得到和使用具有链长短于C16的合成阴离子磷脂类。合成脂质还可以使用提供脂肪酸链上额外的阴离子基团的脂肪酸得到。例如，并入在羧酸基团上终止的较短脂肪酸链的1-棕榈酰基-2-戊二酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱。

这些天然存在和合成的阴离子脂质可以得自几个商业化来源，例如Avanti polarIipids(Alabaster，AL)或Lipoid LLC(Newark，NJ)或Cordon Pharma(Boulder，CO)或NOFC0rp America(White Plains，NY)。

脂肪酸：

本文所用的“脂肪酸”是具有长脂族尾(链)的羧酸，其为饱和或不饱和的并且具有10或以上个原子的碳原子。该碳原子链可以是直链、支链、饱和、单或多不饱和链。

适合的饱和脂肪酸包括、但不限于：癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、二十二酸、二十四烷酸和二十六酸。

适合的不饱和脂肪酸包括、但不限于：顺式-2-癸烯酸、肉豆蔻烯酸、棕榈油酸、sapienic acid。油酸、反油酸、异油酸、亚油酸、反式亚麻酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、顺式-十八碳四烯酸、二十碳五烯酸和植烷酸。

PEG-羧酸：

本文所用的“PEG-羧酸”是指被羧酸官能化的聚乙二醇(PEG)聚合物。PEG可以被官能化成单官能(一羧酸)或同型双官能(二羧酸)的。官能化PEG可以是直链或支链的。适用于本发明的PEG-羧酸可以具有约1,000-约100,000的平均分子量。

适用于本发明的同型双官能PEG一般可以被描述为COOH-PEG-COOH或如下化学式：COOH-(CH

其中“n”的值随分子量改变。例如，实施例中表示为PEG-10,000-二羧酸的PEG-羧酸是具有10,000分子量的同型双官能PEG。平均分子量在约1,000-约100,000是适合的。典型地，分子量可以为1,000-40,000。

适用于本发明的单官能PEG-羧酸的一种类型一般可以被描述为mPEG-COOH或如下化学式：

CH

其中“n”的值也随分子量改变。例如，实施例中使用的PEG-10000可以是具有如式中所示甲氧基的单官能PEG。平均分子量约为1,000-约100,000是适合的。典型地，分子量可以为1,000-40,000。

适用于本发明的单官能PEG-羧酸的另一种类型一般可以被描述为PEG-COOH或如下化学式：

HO-(CH

适合的PEG-羧酸包括、但不限于PEG-10,000-一羧酸、PEG-20,000-一羧酸、mPEG-1,000-一羧酸、mPEG-2,000-一羧酸、mPEG-5,000-一羧酸、mPEG-10,000-一羧酸、mPEG-20,000-一羧酸、mPEG-30,000-一羧酸、mPEG-40,000-一羧酸、PEG-1,000-二羧酸、PEG-2,000-二羧酸、PEG-3,500-二羧酸、PEG-5,000-二羧酸、PEG-7,500-二羧酸、PEG-10,000-二羧酸和Y-形PEG-40,000-一羧酸。可以将上述涉及的Y-形PEG-羧酸描述如下：

其中“n”的值也决定分子量。

在具体的实施方案中，PEG-羧酸选自：PEG-5,000-一羧酸、PEG-10,000-一羧酸、PEG-20,000-一羧酸、mPEG-5,000-一羧酸、mPEG-10,000-一羧酸、mPEG-20,000-一羧酸、PEG-5,000-二羧酸和PEG-10,000-二羧酸。

适合的PEG-羧酸可以购自Nanocs，Inc.(New York，NY)、JenKem Technology(Allen，TX)或NOF Corp America(White Plains，NY)。

在一些实施方案中，上述阴离子赋形剂的两种或多种(例如PEG-羧酸、阴离子磷脂和脂肪酸)可以用于制剂。例如，PEG-羧酸和阴离子磷脂、PEG-羧酸和脂肪酸或脂肪酸和阴离子磷脂可以用于本发明的药物制剂。在另一个实施方案中，选自脂肪酸、阴离子磷脂和PEG-羧酸的三种或以上的阴离子赋形剂存在于所述药物制剂中。在具体的实施方案中，阴离子赋形剂的组合选自：硬脂酸和mPEG-2,000-DSPE；DPPA和PEG-10,000-二羧酸；DPPA和PEG-3,350；DPPA；DPPA和mPEG-3,350和mPEG-2,000-DSPE。在另一个实施方案中，本文所述的阴离子磷脂类的任意种可以进一步与羧甲基纤维素(CMC)组合，例如mPEG-2000-DSPE和CMC的组合。

阳离子肽类：

本文所用的“阳离子多肽”是指在约5.0pH下携带正电荷的任意多肽。所述阳离子多肽可以包括天然存在的氨基酸残基、非天然存在的氨基酸残基或及其混合物。所述阳离子多肽类的正电荷因存在于多肽序列氨基酸侧链上的阳离子官能团、作为多肽序列氨基酸的α氨基的组成部分或它们两者而产生。所述阳离子多肽的正电荷还可以因连接至肽序列末端或该序列氨基酸侧链上的多肽的阳离子官能团产生。可以存在一个以上阳离子官能团，其存在于阳离子多肽上。例如，所述阳离子多肽可以具有1个、2个、3个、4个、5个、6个或以上个阳离子官能团，它们各自可以提供正电荷。这类官能团包括，例如，氨基(伯、仲或叔)、季铵基团、胍基、脒基、吡啶基、咪唑基、磷鎓基团和锍基。在一个具体的实施方案中，阳离子基团是氨基、胍基或咪唑基。

本发明的阳离子多肽可以具有一个或多个手性中心且由此以许多立体异构体形式存在。所有立体异构体及其混合物都包括在本发明范围内。可以使用制备型HPLC和具有手性固定相的柱分离外消旋化合物或使用本领域技术人员公知的方法将其拆分成各对映体。此外，可以拆分手性中间体化合物并且用于制备本发明的手性化合物。

本文所述的阳离子多肽类可以以一种或多种互变体形式存在。所有互变体及其混合物都包括在本发明范围内。

适用于本发明的阳离子多肽类包括、但不限于如下列出的多肽类别和具体多肽类和式I表示的多肽类。所述阳离子多肽类具有药理学活性。

LHRH(GnRH)激动剂：

亮丙瑞林：Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt(SEQ ID NO：46)

布舍瑞林：Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt(SEQ ID NO：47)：

组氨瑞林：Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-His(Bzl)-Leu-Arg-Pro-NHEt(SEQ ID NO：48)

戈舍瑞林：Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH

地洛瑞林：Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHEt(SEQ ID NO：50)

那法瑞林：Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Nal(2)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH

曲普瑞林：Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH

阿伏瑞林：Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp(2-Me)-Leu-Arg-Pro-NHEt(SEQ ID NO：53)

GnRH拮抗剂：

阿巴瑞克：Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-Ser-(Me)Tyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH

西曲瑞克：Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH

地加瑞克：Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-Ser-Phe(4-(4S)-六氢-2，6-二氧代-4-嘧啶基(羰基)氨基)-D-Phe(4-胍基)-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH

加尼瑞克：Ac-D-Nal(2)-D-Cpa(4)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Harg(Et)

生长抑素类似物：

奥曲肽D-Phe-[Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Thr-ol(SEQ ID NO：58)

兰瑞肽D-Nal(2)-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH

伐普肽D-Phe-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Trp-NH

帕瑞肽(Signifor)环[-(4R)-4-(2-氨基乙基氨基甲酰基氧基)-L-脯氨酰基-L-苯基甘氨酰基-D-色氨酰基-L-赖氨酰基-4-O-苄基-L-酪氨酰基-L-苯基丙氨酰基-](SEQ IDNO：60)

其它肽类：

胰高血糖素

白糊精

普兰林肽

胰岛素

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)

GLP-1激动剂

艾塞那肽

甲状旁腺素(PTH)

促肾上腺皮质素(ACTH)

肉毒毒素

淀粉样蛋白肽

缩胆囊肽(Cholecystikinin)

降钙素

芋螺毒素

阿坎酸

胃抑制肽

胰岛素样生长因子，包括以重组方式制备的IGF-1，例如Increlex

生长激素释放因子

抗微生物因子

格拉默(Copaxone)

Hematide(peginesatide)

Nasiritide

ANF肽

血管紧张肽

ACTH

人生长激素(hGH)，包括以重组方式制备的hGH

黑皮质素

阿片样肽

强啡肽

缩宫素

缩宫素类似物，包括拮抗剂

加压素和类似物；和

生长抑素及其类似物。

式I的阳离子多肽类：

用于本发明的阳离子多肽是式(I)的那些或其药学上可接受的盐：

或其药学上可接受的盐，

其中：

R

R

A

A

A

A

A

A

A

A

其中任意的氨基酸残基是L-或D-构型型。

在实施例的实施方案中，A

在实施例的实施方案中，当A

在实施例的实施方案中，当A

在实施例的实施方案中，当A

在实施例的实施方案中：1)A

在另一个实施方案中，式(I)的多肽类，A

在实施例的实施方案中，A

在另一个实施方案中，式(I)的多肽类，A

在另一个实施方案中，式(I)的多肽类，A

在另一个实施方案中，式(I)的多肽类，A

在一个具体的实施方案中，本发明的化合物是式(I)的那些多肽类，其具有对于MC4R的EC

在另一个实施方案中，本发明的多肽类包括由如下结构式的任意一种表示的多肽：

/>

或其药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，本发明的多肽类包括如下结构式的任意一种：

或其药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，本发明的多肽类包括由如下结构式的任意一种表示的多肽：

或其药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，本发明的多肽类包括由式(I)表示的多肽，其中A

Ac-Arg-环[Cys-D-Ala-His(3-Me)-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[Cys-D-Ala-His(1-Me)-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[Cys-D-Ala-Trp-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[Cys-D-Ala-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[Cys-D-Ala-Asn-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[Cys-D-Ala-Arg-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[Cys-D-Ala-Tyr-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[Cys-D-Ala-D-Pro-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[Cys-D-Ala-Pro-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[Cys-D-Ala-Pro-D-Phe(p-F)-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[Cys-D-Ala-Atc-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[Cys-D-Ala-QAla-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[Cys-D-Ala-sChp-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[Cys-D-AIa-X-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

在实施例的实施方案中，本发明的多肽类包括由如下结构式的任意一种表示的多肽：

Ac-Arg-环[hCys-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[hCys-D-AIa-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[hCys-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Pen]-NH

Ac-Arg-环[Glu-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Dpr]-NH

Ac-Arg-环[Glu-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Dpr]-NH

Ac-Arg-环[hCys-Aib-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[hCys-Sar-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[hCys-Val-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[hCys-D-Val-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[hCys-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[hCys-D-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[hCys-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Pen]-NH

Ac-Arg-环[D-Pen-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-hCys]-NH

Ac-Arg-环[Cys-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-hCys]-NH

Ac-Arg-环[Pen-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-hCys]-NH

Ac-Arg-环[D-hCys-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[hCys-Pro-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[hCys-D-Pro-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

或其药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，本发明的多肽类包括式(I)表示的多肽类，其中A

Ac-Arg-环[Cys-Val-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[Cys-D-Val-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[Cys-D-Val-His(1-Me)-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

或其药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，本发明的多肽类包括由如下结构式的任意一种表示的多肽：

Ac-TzAla-环[Cys-Ala-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

或

Ac-Glu-环[Cys-Ala-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

或其药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，本发明的多肽类包括由如下结构式的任意一种表示的多肽：

Ac-Arg-环[Cys-D-Ala-His(1-Me)-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[Cys-D-Ala-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[Cys-D-Ala-Asn-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

或其药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，本发明的多肽类包括由如下结构式的任意一种表示的多肽：

Ac-Arg-环[Cys-D-Leu-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[Cys-D-Ile-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[Cys-D-Tle-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[Cys-D-Val-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH

或其药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，本发明的多肽类包括由如下结构式的任意一种表示的多肽：

Ac-Arg-环[Cys-D-Ala-His(1-Me)-D-2-Nal-Arg-Trp-Cys]-NH

Ac-Arg-环[Cys-D-Ala-Gln-D-2-Nal-Arg-Trp-Cys]-NH

或

Ac-Arg-环[Cys-D-Ala-Asn-D-2-Nal-Arg-Trp-Cys]-NH

或其药学上可接受的盐。在本发明另外的肽类(eptides)中包括由如下结构式的任意一种表示的多肽：

Ac-Arg-环[Cys-D-Ala-His(1-Me)-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-OH(SEQ ID NO：87)；

Ac-Arg-环[Cys-D-Ala-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-OH(SEQ ID NO：88)；或

Ac-Arg-环[Cys-D-Ala-Asn-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-OH(SEQ ID NO：89)，

或其药学上可接受的盐。

在一个可选的实施方案中，用于本发明的阳离子肽类是式(II)的那些或其药学上可接受的盐：

如下结构式(II)的分离的多肽：

或其药学上可接受的盐，

其中：

R

R

A

A

A

A

A

其中：

R

R

R

A

其中：

R

R

R

A

A

A

在实施例的实施方案中，A

其余变量的值和优选值如本文对于式(I)所定义。

单独的或作为较大部分例如“羟基烷基”、“烷氧基烷基”、“烷基胺”的组成部分的“烷基”是指具有指定碳原子数、典型地具有1-12个碳原子的直链或支链饱和脂族基团。更具体地，所述脂族基团可以具有1-8、1-6或1-4个碳原子。该术语以如下基团为示例，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基等。

“卤代烷基”是指被一个或多个卤原子取代的烷基。

“卤素”和“卤代”是指氟、氨、溴或碘。

“氰基”是指基团-CN。

“Ph”是指苯基。

“羰基”是指二价-C(O)-基团。

单独的或作为如“芳烷基”中的较大部分的组成部分的“芳基”是指具有单环或多个稠合环的6-18个碳原子的芳族碳环。术语“芳基”还包括与环烷基或杂环烷基稠合的芳族碳环。芳基的实例包括苯基、苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯、萘基、菲基等。

“芳氧基”是指-OAr基团，其中O是氧原子，且Ar是如上述所定义的芳基。

“芳烷基”是指具有至少一个被芳基部分例如苄基、-(CH

单独的或作为如“杂芳烷基”中的较大部分的组成部分的“杂芳基”是指5-18元单环、双环或三环杂芳族环系，其包含1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子。术语“杂芳基”还包括与环烷基或杂环烷基稠合的杂芳族环。杂芳基的具体实例包括任选取代的吡啶基、吡咯基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、吡唑基、1，2，3-三唑基、1，2，4-三唑基、1，2，3-噁二唑基、1，2，4-噁二唑基、1，2，5-噁二唑基、1，3，4-噁二唑基、1，3，4-三嗪基、1，2，3-三嗪基、苯并呋喃基、[2，3-二氢]苯并呋喃基、异苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并三唑基、异苯并噻吩基、吲哚基、异吲哚基、3H-吲哚基、苯并咪唑基、咪唑并[1，2-a]吡啶基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹嗪基、喹唑啉基、酞嗪基(pthalazinyl)、喹喔啉基(quinoxalinyl)、噌啉基、萘啶基、吡啶并[3，4-b]吡啶基、吡啶并[3，2-b]吡啶基、吡啶并[4，3-b]吡啶基、喹啉基、异喹啉基、四唑基、1，2，3，4-四氢喹啉基、1，2，3，4-四氢异喹啉基、嘌呤基、蝶啶基、咔唑基、呫吨基、苯并喹啉基等。

“杂芳烷基”是指具有至少一个被杂芳基部分例如-CH

“烷氧基”是指基团-O-R，其中R是“烷基”、“环烷基”、“链烯基”或“炔基”。烷氧基的实例包括，例如甲氧基、乙氧基、乙烯氧基等。

“羟基烷基”和“烷氧基烷基”是分别被羟基和烷氧基取代的烷基。

“氨基”是指-NH

“酰基”是指R″-C(O)-，其中R″是H、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、链烯基、取代的链烯基、芳基、烷基芳基或取代的烷基芳基，且在一个具体的实施方案的通式中显示为“Ac”。

“烷基”、“芳基”或“杂芳基”等的适合的取代基是形成本发明稳定的化合物的那些。适合的取代基的实例是选自如下的那些：卤素、-CN、-OH、-NH

取代的Phe上的适合的取代基包括任意芳族碳上的1-5个取代基，所述取代基选自F、Cl、Br、I、-CH

取代的His上的适合的取代基包括任意可取代环原子上的1-3个取代基，所述取代基选自F、Cl、Br、I、-CH

命名“(氨基酸)

本文公开的化合物的药学上可接受的盐包括在本发明内。例如，可以通过使所述化合物与适合的有机酸或无机酸反应得到包含胺或其它碱性基团的化合物的酸式盐，得到药学上可接受的阴离子盐形式。阴离子盐的实例包括乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、溴化物、乙二胺四乙酸钙、右旋樟脑磺酸、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、二盐酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐(glyceptate)、葡糖酸盐、谷氨酸盐、乙二醇基对氨基苯胂酸盐(glycollylarsanilate)、己基间苯二酚酸盐(hexylresorcinate)、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、扑酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐(diphospate)、聚半乳糖酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、次醋酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐、三乙基碘和三氟乙酸盐。

可以通过与适合的碱反应制备包含酸性官能团的化合物的盐。可以使用得到药学上可接受的阳离子的碱制备这种药学上可接受的盐，包括碱金属盐(尤其是钠和钾)、碱土金属盐(尤其是钙和镁)、铝盐和铵盐，以及由生理学可接受的碱形成的盐，例如三甲胺、三乙胺、吗啉、吡啶、哌啶、甲基吡啶、二环己胺、N，N’-二苄基乙二胺、2-羟基乙胺、双-(2-羟基乙基)胺、三-(2-羟基乙基)胺、普鲁卡因、二苄基哌啶、去氢枞胺、-双去氢枞胺、葡萄糖胺、N-甲基葡萄糖胺、可力丁、奎宁、喹啉和碱性氨基酸，例如赖氨酸和精氨酸。

药物组合物

本发明还涉及药物组合物：其包含：离子配合物，该离子配合物包含：阳离子多肽；选自如下的阴离子赋形剂：PEG-羧酸；具有10或以上个碳原子的脂肪酸；阴离子磷脂；及其组合；和药学上可接受的载体。在一个实施方案中，所述药物组合物还包含如下所述的另外的赋形剂(例如羧甲基纤维素(CMC))。例如，本文所述的任意阴离子磷脂类(phospholipids)可以与羧甲基纤维素(CMC)组合，例如mPEG-2000-DSPE和CMC的组合。

所述阳离子肽和阴离子赋形剂的浓度比根据多肽中的阳离子电荷与阴离子赋形剂的电荷的摩尔比确定。例如，相对于多肽的一个正电荷，阴离子赋形剂的量可以为1：1-1：10。对于多肽中另外的正电荷，可以由此调整阴离子赋形剂的比例。通过改变该比例内阴离子赋形剂的量，可以调节多肽的体内释放特性。较高的比例典型地可以产生提供多肽从施用部位的释放比较低比例缓慢的组合物。

本发明药物组合物中的术语“药学上可接受的载体”是指生物相容性极性液体。液体的极性有助于维持配合物的离子形式。生物相容性极性液体包括、但不限于PEG(聚乙二醇，例如具有100-5000的平均分子量的聚乙二醇)、多元醇(例如丙二醇(PG)、三丙二醇、甘油)、乙醇、苄醇、DMSO、NMP、DMF、水、pH缓冲溶液及其混合物。应当理解，如下所述的另外的稀释剂和另外的赋形剂可以包括在所述药物组合物中。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物在注入个体时形成药物储库。在一些实施方案中，在注入个体后所述药物储库随时间释放活性化合物。在一个方面，所述药物组合物的至少部分沉淀以形成药物储库，并且在注入个体时随时间释放药理学活性化合物。在一些实施方案中，本发明的组合物考虑到了适合于在体内生成用于缓释稳态治疗有效水平的多肽的药物储库的高浓度的结构式(I)的多肽。制剂中结构式(I)的多肽的浓度范围的实例约为0.0001mg/mL-约100mg/mL。

本发明的药物组合物可以包括另外的赋形剂(本文中也称作辅助赋形剂)。另外的赋形剂的适合的实例包括如本文所定义的pH稳定缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、稳定剂、抗氧化剂、张度剂和离子和非离子聚合物。

可以加入这类辅助赋形剂以有助于形成离子配合物的均匀混悬液和分散液，乃至疏水性类型的阴离子赋形剂，例如，脂质或脂肪酸。辅助赋形剂的种类包括分散剂和乳化剂，例如卵磷脂、大豆油、蓖麻油、migliol、聚乙二醇(MW范围在200-5,000)、甲基纤维素和羧甲基纤维素。

本文所用的术语“表面活性剂”是指倾向于降低其中溶解的液体的表面张力的表面活性试剂或物质。适合的表面活性剂包括聚山梨醇酯类、伯洛沙姆类、Triton、十二烷硫酸钠、月桂硫酸钠和甜菜碱。例如，表面活性剂包括聚氧乙烯(20)月桂山梨坦(

本文所用的术语“张度剂”是指用于调节制剂张度的物质。张度通常是指通常相对于人血清的溶液渗透压。制剂可以是低渗的、等渗的或高渗的。制剂典型地优选是等渗的。等渗制剂是液体或由固体形式例如冻干形式再溶解的液体，且表示具有与它所对比的一些其它溶液相同张度的溶液，例如生理盐水溶液和血清。张度剂可以有助于减轻注射时的疼痛和刺激。适合的张度剂包括葡萄糖、甘油、羟乙基淀粉、乳糖、甘露糖醇(例如D-甘露糖醇)、棉子糖、山梨醇、蔗糖、海藻糖、氯化钠、氯化钙、氯化镁和氯化钾。

本文所用的术语″缓冲剂″表示稳定药物组合物pH的赋形剂。适合的缓冲剂是本领域众所周知的且可以在文献中找到。适合的缓冲剂的实例包括组氨酸-缓冲剂、柠檬酸盐-缓冲剂、琥珀酸盐-缓冲剂、乙酸盐-缓冲剂和磷酸盐-缓冲剂或其混合物。最优选的缓冲剂包含柠檬酸盐、L-组氨酸或L-组氨酸和L-组氨酸盐酸盐的混合物。另外优选的缓冲剂是柠檬酸盐缓冲剂。与所用缓冲剂独立地，可以使用本领域公知的酸或碱调整pH，例如盐酸、乙酸、磷酸、硫酸和柠檬酸、氢氧化钠和氢氧化钾。

适合于作为另外的赋形剂使用的离子聚合物包括离子羧甲基纤维素(CMC)、透明质酸、聚(谷氨酸)、聚(天冬氨酸)、聚(谷氨酸-共-甘氨酸)、聚(天冬氨酸-共-甘氨酸)、聚(谷氨酸-共-丙氨酸)、聚(天冬氨酸-共-丙氨酸)、甘醇酸淀粉钠、多聚半乳糖醛酸、聚(丙烯酸)、角叉菜胶和藻酸。

在一些实施方案中，CMC具有约5,000-约700,000的平均分子量。在一些实施方案中，甲基纤维素和羧甲基纤维素可以有助于调节所述离子配合物的粘度，以增强活性化合物的药物储库的缓释并且在注入个体时随时间释放活性化合物。

适合于作为另外的赋形剂使用的非离子聚合物包括具有约100-100,000、例如约100-约60,000、例如约100-约10,000例如约100-约5000的MW的聚乙二醇。其它分子量范围包括约200-约60,000。中性聚合物的适合的实例包括PEG-3350和PEG-3400。聚乙二醇聚合物包括PEG和mPEG，其可以为一甲氧基或二甲氧基。PEG在结构上可以如下所示：

HO-(CH

其中“n”的值随分子量改变。例如，PEG-3500酸具有3,500的分子量。

mPEG可以具有如下两种结构之一：

一甲氧基mPEG：CH

二甲氧基mPEG：CH

可以向本发明的药物组合物中加入稀释剂，以便进一步溶解或混悬本发明的离子配合物。稀释剂包括生物相容性材料，例如低粘度的非水可注射的液体。低粘度的非水可注射的液体包括蓖麻油、植物油、矿物油、角鲨烯、单酸甘油酯类、二脂酰甘油酯类、甘油三酯类或甘油酯类的混合物。在一些实施方案中，所述稀释剂是

本文所用的“药物储库”是指可以在注射本发明的药物组合物后形成的沉淀。这些组合物可以在注入个体时形成活性化合物的缓释药物储库并且随时间释放活性化合物。在一个方面，在注入个体时，组合物的至少部分沉淀并且随时间释放药理学活性化合物。

“防腐剂”是加入到制剂中减少制剂中细菌活动或不期望的化学改变的化合物。防腐剂的实例包括苄醇、乙醇、甲醇、异丙醇、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、cathechol、2-氯酚、间-甲酚、苯酚、间苯二酚、木糖醇、2，6-二甲基环己醇、2-甲基-2，4-戊二醇、聚乙烯吡咯烷酮、苄索氯铵、硫柳汞(硫柳汞(thimersosal))、苯甲酸、苯扎氯铵、三氯叔丁醇、苯甲酸钠、丙酸钠和西吡氯铵。

治疗方法

本发明涉及所述离子配合物和包含它们的药物组合物在治疗患有响应于所述离子配合物的阳离子多肽具有的药理学活性的疾病或障碍的个体中的用途。在一个实施方案中，待治疗的障碍响应于需要治疗的个体的MC4R调节。该方法包括对所述个体适用有效量的包含MC4R调节剂、例如本文所述的式I中所述的那些作为阳离子多肽的离子配合物。在一个具体的实施方案中，响应于MC4R调节的障碍包括1型糖尿病、2型糖尿病、肥胖、胰岛素抵抗、代谢综合征、男性勃起功能障碍、女性性功能障碍、非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪性肝炎、物质滥用障碍，包括酒精中毒性进食障碍、恶病质、炎症和焦虑。

在一些实施方案中，包含式I的阳离子多肽的离子配合物和药物组合物对于MC4R和黑皮质素-3受体(MC3R)的选择性和性能高于对黑皮质素-1受体(MC1R)。本发明的离子配合物和药物组合物可以减少或消除不期望的副作用，如血压效应增加、心率增加、对性唤起的不期望的作用和皮肤色素沉着增加。

本文所用的短语“响应于黑皮质素-4受体调节的障碍”是指可以通过活化(激动)或抑制MC4R治疗的任意障碍。这类障碍的实例在下文中详细描述。

本文所用的术语“调节剂”是指与靶受体发生相互作用并且影响其生物功能的化合物。调节剂的实例包括全激动剂、部分激动剂、中性拮抗剂和反激动剂。

本文所用的术语“激动剂”是指天然存在的或合成的在与其本文的靶标MC4R发生相互作用(例如与之结合)时将MC4R的信号传导活性升至高于其基础水平的任意化学化合物。激动剂可以是超兴奋制(即能够产生大于靶受体的内源性激动剂的最大响应且由此具有100％以上效能的化合物)、全激动剂(即在受体占据和活化之后引起最大响应的化合物)或部分激动剂(即可以活化受体、但不能引起受体系统的最大响应的化合物)。MC4R激动剂的实例如在下文中详细描述。

本文所用的术语“拮抗剂”是指在与其本文的靶标MC4R发生相互作用(例如与之结合)时以剂量依赖性方式阻断激动剂化合物与MC4R的信号传导活性的任意化学化合物。

本文所用的术语“反激动剂”是指在与其本文的靶标MC4R发生相互作用(例如与之结合)时以剂量依赖性方式降低MC4R的信号传导活性的基础水平的任意化学化合物。

本文所用的“有效量”是指以治疗或预防方式足以治疗目标障碍的作为离子配合物或包含该离子配合物的药物组合物的药理活性剂的用量。有效量的实例典型地约为0.0001mg/kg体重-约500mg/kg体重。实例范围约为0.001mg/kg体重-约500mg/kg。例如，有效量可以约为0.005mg/kg-约500mg/kg。在其它实例中，该范围约为0.0001mg/kg-约5mg/kg。在其它实例中，有效量约为0.01mg/kg体重-50mg/kg体重或0.01mg/kg体重-20mg/kg体重。

本文所用的术语“第二种活性剂”包括任意活性药物成分(API)，在与本文所述的肽组合时，其增强由单独的本文所述的肽产生的治疗作用或显示与本文所述的肽的协同作用(即显示大于累加作用的联合作用)。本文所用的“增强的治疗作用”包括非协同作用的改善的治疗特性。增强的治疗作用的实例包括降低的本文所述的肽的有效剂量、本文所述的肽的延长的治疗窗等。可以施用一种或多种第二种活性剂。第二种活性剂的实例在下文中详细描述。

可以在本文所述的肽施用之前、与之同时或之后施用第二种活性剂。因此，可以将本文所述的肽和第二种活性剂在单一制剂中一起施用或可以将它们在单独的制剂中例如同时或依次施用。例如，如果本文所述的肽和第二种活性剂在单独的组合物中依次施用，则可以将本文所述的肽在第二种治疗剂之前或之后施用。此外，可以将本文所述的肽和第二种活性剂使用类似的给药方案施用。例如，本文所述的肽和第二种治疗剂可以具有不同的半衰期和/或以不同的时间期限起作用，使得将本文所述的肽以比第二种治疗剂更大的频率施用，或反之亦然。最终，可以在本文所述的肽之后施用第二种活性剂，作为连续施用两种治疗剂的结果，可以进一步增强治疗效能。可以将本文所述的肽或第二种活性剂紧急地或长期施用。

可以通过共同施用第一种用量的具有MC4R调节剂活性的化合物或其药学上可接受的盐和第二种用量的至少一种第二种活性剂实现本发明方法或组合物中的有效量。在一个实施方案中，可以以相应的有效量各自施用本文所述的肽和第二种活性剂(即如果单独施用可以为治疗有效各自用量)。在另一个实施方案中，以单独不提供治疗作用的用量(亚治疗剂量)各自施用本文所述的肽和第二种活性剂。在另一个实施方案中，可以以有效量施用本文所述的肽，而以亚治疗剂量施用第二种活性剂。在另一个实施方案中，可以以亚治疗剂量施用本文所述的肽，而以有效量施用第二种活性剂。在实施例实施方案中，本文所述的肽和第二种活性剂的组合显示比单独的本文所述的肽或第二种活性剂增强的治疗作用或协同作用。

可以使用用于评价药物相互作用的适合的方法确定协同作用的存在。适合的方法包括，例如Sigmoid-Emax方程(Holford，N.H.G.和Scheiner，L.B.，Clin.Pharmacokinet.6：429-453(1981))、Loewe加和性方程(Loewe，S.和Muischnek，H.，Arch.Exp.Pathol.Pharmacol.114：313-326(1926))和中间-效应方程(Chou，T.C.和Talalay，P.，Adv.Enzyme Regul.22：27-55(1984))。上文涉及的每个方程可以配有实验数据，生成相应的示意图，以辅助评价药物组合的作用。与上文涉及的方程相关的相应示意图分别是浓度-效应曲线、等效线图解曲线和联合指数曲线。

本文所用的“个体”是指哺乳动物，优选人，但还可以指需要兽医治疗的动物，例如陪伴动物(例如狗、猫等)、农场动物(例如牛、绵羊、猪、马等)和实验室动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠等)。

本文所用的“治疗”包括部分或基本上实现延迟、抑制或预防与目标障碍相关的临床适应征的发展。例如，“治疗”包括部分或基本上实现如下结果的一种或多种：部分或完全减轻体重(例如，正如根据人体质量指数BMI所确定的)；改善或改进与肥胖相关的临床症状或指征，例如II型糖尿病、前驱糖尿病病症、血红蛋白A1C(Hb1Ac)的血液水平高于6％、高胰岛素血症(hyperinsulimenia)、高脂血症、胰岛素无敏感性、葡糖耐受不良等；延迟、抑制或预防肥胖和肥胖相关适应征发展；或部分或完全延迟、抑制或预防肥胖或肥胖相关适应征发作或发展。延迟、抑制或预防肥胖发展包括，例如延迟、抑制或预防具有正常体重的个体发展成肥胖。术语“治疗”还包括部分或完全降低冠状动脉疾病、中风和与代谢综合征相关的糖尿病(例如2型)的风险和改善或改进与代谢综合征相关的代谢综合征的临床症状或征兆，例如上述5种指征的任意一种或多种。例如，“治疗”包括延迟、抑制或预防与代谢综合征包括胰岛素抵抗、葡萄糖清除相关的参数和心血管疾病参数包括心率和血压发展，关节病、炎症、睡眠呼吸暂停、贪食症和其它进食障碍，包括食欲亢进、用于体重减轻的支持疗法和矫形外科前的支持型体重减轻疗法。“预防性治疗”是指在目标障碍的临床症状发作前的治疗以预防、抑制或降低其发生率。

响应性障碍

响应于MC4R调节的障碍且更一般地是响应于上述列出的多肽类别和具体多肽的药理学作用的障碍的实例包括急性和慢性炎症疾病诸如泛发性炎症、炎性肠病、脑炎症、脓毒症和脓毒性休克；具有自身免疫成分的疾病，例如类风湿性关节炎、痛风性关节炎和多发性硬化；代谢疾病和伴有体重增长的医学病症，例如肥胖、进食障碍和帕-魏二氏综合征；代谢疾病和伴随体重减轻的医学病症，例如食欲减退、食欲亢进、艾滋病消耗、恶病质、癌症恶病质和虚弱老人消瘦；糖尿病和糖尿病相关病症和糖尿病并发症，例如视网膜病变；瘤性增生，例如皮肤癌和前列腺癌；生殖或性医学病症，例如女性中的子宫内膜异位症和子宫出血、性功能障碍、勃起功能障碍和女性中的性反应减少；因治疗产生的疾病或病症或生物体创伤，例如器官移植排斥、局部缺血和再灌注损伤、脊髓损伤治疗和加速伤口愈合以及由化疗、放疗、短暂或永久性固定导致的体重减轻和透析；心血管疾病或病症，例如出血性休克、心源性休克、低血容量性休克、心血管障碍和心原性恶病质；肺部疾病或病症，例如急性呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺疾病、哮喘和肺纤维化；增强免疫耐受性和抗击对免疫系统的攻击，例如与一些过敏原或器官移植排斥相关的那些；治疗皮肤病和病症，例如银屑病、皮肤色素沉着耗尽、痤疮、瘢痕疙瘩形成和皮肤癌；行为、中枢神经系统或神经元性病症和障碍，例如焦虑、抑郁症、记忆和记忆力功能障碍、调节疼痛感觉和治疗神经性疼痛；与饮酒、酒精滥用和/或酒精中毒相关的病症和疾病；和肾病症或疾病，例如治疗肾病性恶病质或钠尿增多。另外的实例包括个体的正常或稳态的活动，包括甲状腺素释放、醛固酮合成和释放、体温、血压、心率、血管紧张度、脑血流量、血糖水平、骨代谢、骨形成或发育、卵巢重量、胎盘形成、催乳素和FSH分泌、子宫内胎儿发育、分娩、精子发生、皮脂和信息素分泌、神经保护和神经生长和调节动机、学习和其它行为。其它实例包括贪食症、食欲亢进或其它进食障碍。

在实施例实施方案中，响应于MC4R受体调节的障碍是1型糖尿病、2型糖尿病、肥胖、胰岛素抵抗、代谢综合征、心血管疾病或低密度脂蛋白/高密度脂蛋白/甘油三酯不平衡、非酒精性脂肪肝病和物质滥用障碍。

在实施例实施方案中，响应于MC4R受体调节的障碍是1型糖尿病、2型糖尿病、肥胖、胰岛素抵抗或代谢综合征。

肥胖

本文所用的术语“肥胖”是指具有约30kg/m

糖尿病和相关障碍

在实施例实施方案中，用本发明提供的方法治疗的个体具有发生糖尿病相关障碍和处于增加的发生它们的风险中。“糖尿病相关障碍”是指糖尿病(包括1型(OMIM 222100)和2型(OMIM 125853))、胰岛素抵抗和代谢综合征。

在实施例实施方案中，待治疗的个体具有糖尿病(1型2型)、胰岛素抵抗或代谢综合征。在实施例实施方案中，所述障碍是糖尿病，例如2型糖尿病。在实施例实施方案中，所述个体具有发生如世界卫生组织(World Health Organization)和国际糖尿病联合会(International Diabetes Federation)在2006年公布的“Definition and diagnosis ofdiabetes mellitus and intermediate hyperglycaemia”所定义的2型糖尿病或处于增加的发生它的风险中，将这些文献完整地引入本文作为参考。在实施例实施方案中，糖尿病个体显示空腹血糖＞＝126mg/dL或2-小时血糖(口服施用75g葡萄糖后2小时)＞＝200mg/dL。在实施例实施方案中，糖尿病或前驱糖尿病显示糖化血红素水平升高，例如大于4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6％或更高的总血红蛋白。在实施例实施方案中，糖尿病或前驱糖尿病可以根据遗传多态现象(包括，例如，导致表达水平改变的多态现象，例如升高或降低的表达水平和/或编码序列的变化)或接近如下表1中基因的一种或多种鉴定或进一步表征：

表1

在实施例实施方案中，可以用于鉴定或进一步表征用本发明提供的方法治疗的个体的另外的基因包括FTO(OMIM 610966)、JAZF1(OMIM 606246)和HHEX(OMIM 604420)。

在实施例实施方案中，可以用本发明提供的方法治疗的个体具有I型糖尿病。在实施例实施方案中，具有I型糖尿病的个体通过C-肽测定表征，例如禁食C-肽水平低于约1.0nmol/L，例如低于1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4nmol/L或更低，例如低于0.33、0.25、0.2或0.1nmol/L。在实施例实施方案中，在口服葡萄糖攻击后(口服施用75g葡萄糖后2小时)测定C-肽水平，并且检测到低于0.54nmol/L、例如低于0.50、0.45、0.40、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15或0.10nmol/L的增加。空腹葡萄糖受损(110-125mg/dL)或葡萄糖耐量降低(75-g葡萄糖攻击后2-h：140-199mg/dL)可以用于鉴定或进一步表征具有1型糖尿病的个体的β细胞功能降低。在实施例实施方案中，根据存在针对胰岛细胞抗原和/或胰岛素的自身抗体鉴定或进一步表征1型糖尿病，例如定向于65kDa GAD(OMIM 138275)和/或磷酸酶相关IA-2分子的自身抗体。

胰岛素抵抗

在实施例的实施方案中，所述障碍是“胰岛素抵抗”，其可以通过本领域公知的任意方式鉴定并且根据胰岛素降低血糖水平的能力下降表征。在实施例实施方案中，根据存在的如下基因的一种或多种中的一种或多种多态现象(包括，例如，导致表达水平改变的多态现象，例如升高或降低的表达水平和基因产物例如蛋白质的编码序列变体)鉴定或进一步表征胰岛素抵抗：RETN、PTPN1、TCF1(OMIM 142410；参见，例如多态现象0011)、PPP1R3A(OMIM 600917；参见，例如多态现象0001、0003)、PTPN1(OMIM 176885；参见，例如多态现象0001)、ENPP1(OMIM 173335；参见，例如多态现象0006)、IRS1(OMIM 147545；参见，例如多态现象0002)、EPHX2(OMIM 132811；参见，例如多态现象0001)、瘦素(OMIM 164160，参见，例如多态现象0001和0002)、瘦素受体(OMIM 601007，参见，例如多态现象0001、0002、0004和0005)或胰岛素受体(INSR、OMIM 147670，参见，例如多态现象0001-0037)。

代谢综合征

在实施例的实施方案中，所述障碍是代谢综合征。本文所用的术语“代谢综合征”是指共同发生且增加冠状动脉疾病、中风和2型糖尿病的风险的一组症状。根据美国心脏协会和国家心脏、肺和血液研究院(American Heart Association and the NationalHeart，Lung and Blood Institute))，如果个体具有如下征兆的三种或三种以上，则存在代谢综合征，也称作X综合征：

1)血压等于或高于130/85mmHg；

2)空腹血糖(葡萄糖)等于或高于100mg/dL；

3)巨大腰围(围绕腰部的长度)：

-男性-40英寸或以上；

-女性-35英寸或以上；

4)低HDL胆固醇：

-男性-40mg/dL以下；

-女性-50mg/dL以下；

5)甘油三酯类等于或高于150mg/dL。

代谢综合征可以通过测试个体的血压、血糖水平、HDL胆固醇水平、LDL胆固醇水平、总胆固醇水平和甘油三酯水平来诊断。

在实施例的实施方案中，个体具有向心性肥胖(女性腰围＞＝80cm；亚洲男性＞＝90cm，包括南美和中美洲人种；和所有其他男性＞＝94cm)、BMI＞30kg/m

MC4R突变导致的障碍

本发明涉及治疗患有MC4R对α-黑皮质素刺激激素(α-MSH)减弱的响应的个体的障碍的方法。该方法包括施用有效量的黑皮质素-4受体(MC4R)激动剂。在一个实施例实施方案中，所述个体是MC4R突变的杂合子携带者，导致MC4R对α-黑皮质素刺激激素(α-MSH)响应减弱。因为杂合子载体保留了对MC4R天然配体有响应的能力，所以通过施用MC4R激动剂治疗MC4R-相关障碍不依赖于MC4R突变类型的知识。

在一个实施例实施方案中，所述障碍是肥胖，例如MC4R-相关肥胖。在另一个实施例实施方案中，所述障碍是代谢综合征。

人MC4R基因(hMC4R)是由具有GenBank保藏号CH471077的基因组序列编码的充分表征的蛋白质。

MC4R受体中的突变是严重儿童期肥胖的相关原因。已经注意到在青少年发作的肥胖人群中MC4R突变的携带者患病率约为2.5％，在严重肥胖儿童中的最高患病率为6％。具有MC4R突变的人显示大致上类似的表型，正如对于在具有MC4受体基因中的突变的小鼠描述的。那些人显示明确的摄食过度、超高胰岛素血症、脂肪量增加，伴随瘦体质、骨矿物质密度和直线性生长率，其中皮质醇水平、促性腺素、甲状腺和性类固醇水平不变。与MC4受体缺失相反，摄食过度和超高胰岛素血症倾向于人体个体中的年龄而减退。与MC4R敲除小鼠类似，杂合子携带者中的表型与纯合子携带者相比属于中间型的。在试验餐时观察到的显示出的摄食过度的严重性低于具有瘦素缺乏的人中观察到的水平。体外测定中观察到的MC4受体功能障碍的严重性预示由隐藏特定突变的个体在试验餐时摄入的食物量，并且与肥胖表型发作和严重性相关。至少90种不同的MC4受体突变与肥胖相关，且能够发现MC4受体中的另外的突变，它们导致类似的肥胖表型。

导致人肥胖的MC4R突变的实例描述在Farooqi等人，The Journal of ClinicalInvestigation，2000年7月，106卷(2)，pp.271-279和Vaisse等人，The Journal ofClinical Investigation，2000年7月，106卷(2)，pp.253-262中，将这些文献的相关部分引入本文作为参考。

可能导致人肥胖的另外的突变包括R18H、R18L、S36Y、P48S、V50M、F51L、E61K、I69T、D90N、S94R、G98R、I121T、A154D、Y157S、W174C、G181D、F202L、A219V、I226T、G231S、G238D、N240S、C271R、S295P、P299L、E308K、I317V、L325F和750DelGA，如Xiang等人，“Pharmacological characterization of30human melanocortin-4receptorpolymorphisms with the endogenous proopiomelanocortin-derived agonists，synthetic agonists and the endogenous agouti-related protein antagonist.”Biochemistry，2010Jun 8；49(22)：4583-600中所述，将该文献的相关部分引入本文作为参考。

可能导致人肥胖的突变的另外的实例是在URL http://omim.org/entry/155541的Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM)，一个人基因和家族遗传疾病数据库，登记号为155541(MC4R)(更精确地，保藏号为155541.0001-155541.0023)中列出的那些。有代表性的实例包括4-BP DEL、NT631；4-BP INS、NT732；TYR35TER；ASP37VAL；SER58CYS；ILE102SER；ASN274SER；1-BP INS、112A；4-BP DEL、211CTCT；ILE125LYS；ALA175THR；ILE316SER；TYR287TER；ASN97ASP；15-BP DEL(δ88-92密码子)；和SER127LEU。将OMIM数据库的相关部分引入本文作为参考。

在实施例实施方案中，MC4R突变导致MC4R信号传导活性保留。

可以通过本领域技术人员众所周知的方法检测编码MC4R的基因组序列中的突变。例如，可以使用核苷酸引物例如Farooqi等人，The Journal of Clinical Investigation，2000年7月，106卷(2)，pp.271-279和Vaisse等人，The Journal of ClinicalInvestigation，2000年7月，106卷(2)，pp.253-262中所述的引物克隆所述基因组序列，并且使用商购测序仪和软件分析克隆的序列。

可以通过本领域技术人员众所周知的方法测定MC4R的活性。例如，可以用克隆的MC4R DNA瞬时转染细胞，使转染的细胞接触MC4R激动剂(例如α-MSH)，并且通过例如Roubert等人在Journal of Endocrinology(2010)207，pp.177-183中所述的电化发光测定法测定cAMP即MC4R的第二信使的胞内水平。可以通过比较作为对野生型MC4R的指定激动剂响应产生的cAMP胞内水平与突变MC4R产生的cAMP胞内水平确定MC4R信号传导减少。

MC4R调节剂(例如激动剂)还可以用于治疗患有其它障碍的患者，例如MC4R天然激动剂的利用度降低。这类患者的实例包括对于在瘦素依赖性途径中重要的基因中的突变(Nature Clinical Practice Endocrinology and Metabolism，2006；2；6；318和NEng JMed：2007；356；3；237)、阿黑皮素加工(Nature Genetics，1998，155；Cell Metabolism，2006；3；135；Annals Acad Med，2009，38；1；34)或编码前蛋白转化酶类的基因中的突变为杂合或纯合的个体。

施用方式

用于实施本文所述方法的离子配合物或药物组合物的施用可以是连续的，每小时1次，每日4次，每日3次，每日2次，每日1次，隔天1次，每周2次，每周1次，每隔2周1次，每月1次或每隔2个月1次，每隔3个月1次，每隔4个月1次，每隔5个月1次或每隔6个月1次或更长时间1次或一些另外的间歇式给药方案。本发明的离子配合物(comple)组合物适合于以如下范围有效施用：每日1次，每周1次，每隔2周1次，每隔4周1次，每隔2个月1次，每隔3个月1次，每隔4个月1次，每隔5个月1次或每隔6个月1次。

适合的施用方法包括、但不限于外周施用。外周施用的实例包括口服、皮下、腹膜内、肌内、静脉内、直肠、透皮、口含、舌下、吸入、肺或鼻内施用形式。优选的实施方案使用皮下施用。

联合疗法

本文所述的任意的肽，无论是离子配合物或非配合物(例如配合前肽1)的组成部分，都可以用于治疗响应于MC4R调节的障碍的任意种，通过施用与一种或多种另外的药物活性化合物(“第二种活性剂”)的组合来进行。这种组合可以通过包括一种或多种本文所述的肽类和一种或多种第二种活性剂的单一剂型来进行，这种单一剂型包括片剂、胶囊、喷雾剂、吸入粉末、可注射的液体等。或者，组合施用可以通过施用两种不同剂型来进行，其中一种剂型包含一种或多种本文所述的肽类，而另一种剂型包括一种或多种第二种活性剂。在这种情况中，所述剂型可以相同或不同。不意味着限制联合疗法，下文示例了可以使用的一些联合疗法。

可以将本文所述的肽(例如作为离子配合物或非配合物的组成部分)与一种或多种用于治疗不同与体重和进食相关的障碍例如肥胖和/或超重的第二种活性剂组合。特别地，第二种活性剂可以是减肥药，其影响能量消耗、醣酵解、糖原异生、糖原分解、脂解、脂肪生成、脂肪吸收、脂肪储存、脂肪排泄、饥饿和/或饱满感和/或渴望机制、食欲/动机、食物摄入或胃肠活动。减少能量摄取的药物部分包括不同的药理学活性剂，称作食欲减退剂，它们作为辅剂用于减体重程序中的行为疗法。

通常，肥胖控制剂或药物的总剂量在与一种或多种本文所述的肽组合时可以为0.1-3,000mg/天，优选约1-1,000mg/天，且更优选约1-200mg/天，分单次剂量或2-4次分次剂量。然而，确切剂量由主治医师决定且依赖于例如施用的化合物效能、患者年龄、体重、病情和响应这样的因素。

可以将本文所述的一种或多种肽类(作为离子配合物或非配合物的组成部分)与用于治疗糖尿病的一种或多种第二种活性剂组合。

此外，或者，还可以将本文所述的一种或多种肽类与用于治疗与肥胖和/或超重相关的疾病、障碍和/或病症的一种或多种第二种活性剂组合，所述与肥胖和/或超重相关的疾病、障碍和/或病症例如胰岛素抵抗；葡萄糖耐量降低；2型糖尿病；代谢综合征；血脂异常(包括高脂血症)；高血压；心脏病(例如冠心病，心肌梗死)；心血管障碍；非酒精性脂肪肝病(包括非酒精性脂肪性肝炎；关节障碍(包括继发性骨关节炎)；胃食管反流；睡眠呼吸暂停；动脉粥样硬化；中风；大血管病和微血管病；皮脂腺病(例如肝中)；胆石；和胆囊障碍。

第二种活性剂

所述一种或多种第二种活性剂选自，例如：

胰岛素和胰岛素类似物；

胰岛素促泌素，包括磺脲类(例如格列吡嗪)和膳食葡萄糖调节剂(有时称作“短效促泌素”)，例如氯茴苯酸类(例如瑞格列奈和那格列奈)；

改善肠降血糖素作用的活性剂：肠降血糖素，肠降血糖素模拟物，改善肠降血糖素功能的活性剂，例如GLP-1、GIP；GLP-1激动剂(例如艾塞那肽和利拉糖肽(VICTOZA))、DPP-4抑制剂(例如维格列汀、沙格列汀和西格列汀)；

胰岛素致敏剂，包括过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂，例如噻唑烷二酮类(例如吡格列酮和罗格列酮)，和具有PPARα、γ和δ活性的任意组合的活性剂；

调节肝糖平衡的活性剂，例如双胍类(例如二甲双胍)、果糖1，6-二磷酸酶抑制剂、糖原磷酸化酶抑制剂、糖原合成酶激酶抑制剂和葡糖激酶激活物；

为减少/减缓葡萄糖从肠中吸收设计的活性剂，例如α葡糖苷酶抑制剂(例如米格列醇和阿卡波糖)；

拮抗糖原作用或减少其分泌的活性剂，例如白糊精类似物(例如普兰林肽)；

防止葡萄糖被肾重吸收的活性剂，例如钠离子依赖的葡糖转运蛋白2(SGLT-2)抑制剂(例如达格列净)；

为治疗延长的高血糖症并发症设计的活性剂，例如醛糖还原酶抑制剂(例如依帕司他和雷尼司他)；

用于治疗与微血管病相关的并发症的活性剂；

抗血脂异常药，例如HMG-CoA还原酶抑制剂(他汀类药物，例如瑞舒伐他汀)和其它降胆甾醇药；

PPARα激动剂(贝特类，例如吉非罗齐和非诺贝特)；

胆汁酸多价螯合剂(例如考来烯胺)；

胆固醇吸收抑制剂(例如植物甾醇类(即植物甾醇)，合成抑制剂)；

胆固醇酯转移蛋白(CETP)抑制剂；回肠胆汁酸转运系统抑制剂(IBAT抑制剂)；

胆汁酸结合树脂类；

烟酸(尼克酸)及其类似物；

抗氧化剂，例如普罗布考；

ω-3脂肪酸；

抗高血压药，包括肾上腺素能受体拮抗剂，例如β-阻滞剂(例如阿替洛尔)，α阻滞剂(例如多沙唑嗪)和混合型α/β阻滞剂(例如拉贝洛尔)；

肾上腺素能受体激动剂，包括α-2激动剂(例如可乐定)；

血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂(例如赖诺普利)，钙通道阻滞药，例如二氢吡啶类(例如硝苯地平)，苯基烷基胺类(例如维拉帕米)和苯并噻氮卓类(例如地尔硫卓)；

血管紧张素II受体拮抗剂(例如坎地沙坦)；醛固酮受体拮抗剂(例如依普利酮)；

中枢作用肾上腺素能药，例如中枢α激动剂(例如可乐定)；和利尿剂(例如呋塞米)；

止血调节剂，包括抗血栓药，例如纤维蛋白溶解激活物；

凝血酶拮抗剂；

因子VIIa抑制剂；抗凝血药，例如维生素K拮抗剂(例如华法林)、肝素及其低分子量类似物、因子Xa抑制剂和直接凝血酶抑制剂(例如阿加曲班)；抗血小板剂，例如环加氧酶抑制剂(例如阿司匹林)、腺苷二磷酸(ADP)受体抑制剂(例如氯吡格雷)、磷酸二酯酶抑制剂(例如西洛他唑)、糖蛋白IIB/IIA抑制剂(例如替罗非班)和腺苷再摄取抑制剂(例如双嘧达莫)；

减肥药，例如食欲抑制剂(例如麻黄碱)，包括去甲肾上腺素能药(例如芬特明)和血清素类药(例如西布曲明)、胰脂肪酶抑制剂(例如奥利司他)、微粒体转移蛋白(MTP)调节剂、二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)抑制剂和大麻素(CB1)受体拮抗剂(例如利莫纳班)；

摄食行为调节剂，例如阿立新受体调节剂和黑素浓集激素(MCH)调节剂；

神经肽Y(NPY)/NPY受体调节剂；

丙酮酸脱氢酶激酶(PDK)调节剂；

5-羟色胺受体受体调节剂；

瘦素/瘦蛋白受体调节剂；

葛瑞林/胃促生长素受体调节剂；

增强β细胞功能的活性剂；

刺激能量消耗的活性剂(例如β肾上腺素能刺激剂、UCP-1激动剂、棕色脂肪调节剂和刺激剂)；

诱导脂细胞裂解的活性剂(例如抗体)；

烟碱或烟碱戒断助剂；

雌激素，雌激素受体的天然或合成调节剂；

μ-阿片样物质受体调节剂；和

单胺转移调节剂，例如选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)(例如氟西汀)、去甲肾上腺素再摄取抑制剂(NARI)、去甲肾上腺素-5-羟色胺再摄取抑制剂(SNRI)、三元单胺再摄取阻滞剂(例如替索芬辛)和单胺氧化酶抑制剂(MAOI)(例如托洛沙酮和阿米夫胺)或其药学上可接受的盐。

在一个实施例实施方案中，将MC4R激动剂(例如为例子配合物或非配合物的组成部分的MC4R激动剂)和第二种活性剂以施用极低热量饮食(VLCD)或低热量饮食(LCD)同时、依次或单独施用。

制备离子配合物的方法

本发明还涉及制备本发明的离子配合物和药物组合物的方法。该方法包括提供阳离子多肽和选自PEG-羧酸、具有10或以上个碳原子的脂肪酸、磷脂或其组合的阴离子赋形剂，在形成离子配合物的条件下合并所述阳离子多肽和所述阴离子赋形剂，并且制备包含所述离子配合物的药物组合物。

例如，可以将选自PEG-羧酸、具有10或以上个碳原子的脂肪酸、磷脂或其组合的阴离子赋形剂和任意另外的赋形剂在水性介质(例如水)中的混合物通过在适合的条件下高压灭菌该混合物均匀地制成充分分散的状态。适合的条件可以包括，例如，在121℃至134℃约3分钟-约25分钟。适合的条件的实例包括在约121℃约15分钟的时间。高压灭菌的应用还提供了无菌混合物。然后可以向该混合物中添加所述阳离子肽的无菌水溶液，得到本发明的无菌均匀离子配合物。根据所述阴离子赋形剂性质的不同，可以得到所述离子配合物的澄清溶液或均匀混悬液。例如，用于本文所述的实例的PEG-羧酸和mPEG2000-DSPE典型地产生包含所述离子配合物的澄清溶液，而DPPA脂质的应用典型地产生包含所述离子配合物的均匀混悬液。

或者，可以通过将所述赋形剂与所述阳离子多肽一起溶于水并且通过0.2微米滤器无菌过滤得到的混合物制备所述离子配合物的混合物。

制备离子配合物的方法，所述离子配合物包含阳离子多肽和选自如下的阴离子赋形剂：PEG-羧酸；具有10或以上个碳原子的脂肪；磷脂；及其组合，该方法包含：

a)制备所述阴离子赋形剂和水性赋形剂稀释剂的混合物；

b)在足以使所述赋形剂灭菌的条件下对所述混合物进行高压灭菌；

c)将包含阳离子多肽和水性肽稀释剂的无菌肽溶液加入到所述赋形剂混合物中。

在一个实施方案中，所述赋形剂混合物是混悬液。在另一个实施方案中，所述赋形剂混合物是溶液。

在一个可选的实施方案中，本发明涉及制备离子配合物的方法，所述离子配合物包含阳离子多肽和选自如下的阴离子赋形剂：PEG-羧酸；具有10或以上个碳原子的脂肪；磷脂；及其组合，该方法包含：

a)制备所述阴离子赋形剂和水性赋形剂稀释剂的溶液；

b)通过0.2微米滤器过滤步骤a的溶液；

c)将包含阳离子多肽和水性肽稀释剂的无菌肽溶液加入到步骤b的所述赋形剂溶液中。

在另一个实施方案中，本发明涉及制备离子配合物的方法，所述离子配合物包含阳离子多肽和选自如下的阴离子赋形剂：PEG-羧酸；具有10或以上个碳原子的脂肪；磷脂；及其组合，该方法包含：

a)制备包含所述阴离子赋形剂、水性赋形剂稀释剂和阳离子多肽的溶液；

b)降通过0.2微米滤器过滤得到的的溶液灭菌。

适合的赋形剂和阳离子多肽赋形剂的实例包括多元醇(例如丙二醇、三丙二醇、甘油、乙醇、苄醇、DMSO、NMP、DMF、水、pH稳定缓冲溶液及其混合物。

示例

肽合成

通过常规的固相肽合成制备适用于本发明的阳离子多肽类。例如，可以根据美国专利US8,349,797中所述的方法制备本文所述的肽1和其它MC4R类似物，将该文献的全部内容引入本文作为参考。以逐步的方式使肽链从其C-末端氨基酸衍生物开始延伸，所述C-末端氨基酸衍生物偶联在适当选择的已知适合于肽合成的固相支持物树脂上。为了合成具有C-末端酰胺官能团的肽，将Rink酰胺MBHA树脂用作固相支持物。为了合成具有C-末端游离羧基官能团的肽类，使用例如2-氯三苯甲基氯树脂、Wang或Merrifield树脂这样的树脂，它们与Fmoc-氨基酸形成酯键。大部分这些酯连接的Fmoc-氨基酸-树脂类型购自不同来源且一般在切实可行时使用。

二硫化物-环化肽类的合成

使用固相肽合成仪上的Fmoc化学组装二硫化物环肽类的线性衍生物。将Fmoc-Rink酰胺树脂放入反应容器，用NMP溶胀。然后用20％哌啶的NMP溶液处理15分钟，然后用NMP洗涤3次。对树脂进行阳性Kaiser测试(Kaiser，E.，Colescot、R.L.，Bossinge，C.D.&Cook，P.I.Anal.Biochem.，1990，34：595-598)。将其重新混悬于NMP，与所需的第一种C-末端Fmoc-氨基酸衍生物和HOBt混合。通过添加HBTU试剂和DIPEA启动偶合反应。在混合2-3小时后，通过在从该反应混合物中抽取的树脂的小等分部分上的阴性Kaiser试验证实偶合完成。然后用NMP将树脂洗涤3次。此后，如上所述除去Fmoc基团，用所述的第二种C-末端Fmoc-氨基酸衍生物重复整个循环。用新到来的氨基酸各自依次重复同一反应循环。使用氯醌显色试验(Vojkovsky，T.Pept.Res.，1995，8：236-237)替代Kaiser试验，用于的Fmoc从肽序列上的脯氨酸残基上脱保护的阳性测试，也用于测试氨基酸与脯氨酸完全偶合(阴性氯醌试验)。在具有N-末端乙酰基的肽类的情况中，用乙酐和吡啶将Fmoc脱保护的肽树脂处理10分钟。用NMP、二氯甲烷洗涤Kaiser试验测试阴性后的树脂，真空干燥。Fmoc-氨基酸衍生物用于合成这些肽类。所用的三官能团氨基酸衍生物如下：Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-His(Trt)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-hCys(Trt)-OH，Fmoc-Pen(Trt)-OH，Fmoc-Tyr(But)-OH，Fmoc-His(1-Me)-OH，Fmoc-His(3-Me)-OH和Fmoc-Glu(OBut)-OH。

为了从树脂上裂解掉肽和使侧链官能团脱保护，将肽树脂溶于：2％TIS/5％水/5％(w/v)DTT/88％TFA。将该溶液混合3.5小时，然后过滤。将滤液与冷无水乙醚混合。通过离心采集沉淀。滗析溶剂，将肽沉淀重新混悬于新鲜乙醚。将乙醚后处理重复2次以上。真空干燥肽。将粗的线性肽产物稀释至在5％乙酸中2mg/mL浓度，在剧烈搅拌下滴加0.5M碘/甲醇，直到得到持续的淡黄色溶液。将该溶液再搅拌10分钟。然后通过添加1M硫代硫酸钠在混合中使过量的碘猝灭，直到该混合物变成无色为止。冻干环化的肽溶液，通过制备型HPLC、使用反相C-18柱纯化粗粉末。收集纯化的产物级分，冻干。通过质谱法，使用电喷雾电离技术分析肽类，鉴定为正确质量。

内酰胺(Lactm)-环化肽类的合成

还通过标准固相肽合成方法合成环内酰胺肽类。对于具有C-末端Dpr的肽类，将Fmoc-Dpr(Mtt)-BHA树脂转入固相肽合成仪反应器。如上所述除去Fmoc基团，接下来使Fmoc-保护的氨基酸、例如Fmoc-Trp(Boc)-OH与所述树脂通过偶合方法偶合。除去Fmoc保护基，按照正确的顺序，通过重复偶合和脱保护操作各自添加其余的氨基酸，直到氨基酸序列完成。对于谷氨酸，使用偶合Fmoc-Glu(OPip)。然后同样地如上述二硫化物系列肽类所述，在N-末端上使组装完全的肽乙酰化。然后除去正交保护的侧链。例如，通过用1％TFA的二氯甲烷溶液处理裂解具有正交保护的Glu侧链为2-苯基异丙基酯(OPip)或Dpr保护为4-甲基三苯甲基(Mtt)的肽。将脱保护的肽树脂混悬于NMP，用HBTU/DIPEA处理。环化后(阴性Kaiser试验)，用DCM洗涤肽-树脂，干燥。使用三氟乙酸(TFA)在水和1，2-乙二硫醇(EDT)的存在下从树脂上裂解环肽与任何其余的保护基。在添加冷无水乙醚时通过沉淀采集产物，通过离心采集。最终纯化通过反相HPLC、使用反相C-18柱进行。通过冻干采集纯化的肽，通过质谱、使用电喷雾方法分析其质量。

表1：式I的阳离子肽类的实施例

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测试表1的一些阳离子多肽类以便在下属测定法中评价活性。数据如表2中所示。

肽测试：

放射配体结合测定：

用于测定从本发明环肽的受体上置换放射性标记的配体的结合常数(K

作为实例，由为稳定表达hMC受体亚型1、3、4或5而转染的CHO-K1细胞制备用于结合测定的细胞膜制品。[

环AMP刺激测定：

用于测定本发明的环肽的激动剂或激动剂状态的功能性测定可以通过本领域公知的任意方式进行。

电化发光(ECL)测定

以剂量依赖性方式，通过电化发光(ECL)测定法测定所述肽类对胞内环AMP(cAMP)水平的刺激(Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD，USA；下文称作″MSD″)。简言之，将稳定表达hMC受体亚型的CHO-K1细胞混悬于RMPI

cAMP测量试验：

使人MC4-R转染的细胞生长至在96孔板中汇合(以约250,000细胞/孔铺板)。用0.2mM异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)和分等级浓度的肽或在20nM NDP-MSH存在下的肽处理细胞，一式三份的组。类似地，仅用20nM NDP-MSH处理的细胞用作阳性对照，体积为200μL。还包括用作阴性对照的缓冲液空白。在37℃温育1小时后，通过添加50μL细胞裂解缓冲液裂解细胞。使用商购低pH cAMP测定试剂盒(Amersham BioSciences)，按照试剂盒供应商指定的方法对250μL这种温育培养基中蓄积的总cAMP进行定量。将显示在相同或高于作为阳性对照的α-MSH的范围内的cAMP蓄积的肽视为激动剂。将激动剂数据绘图，使曲线拟合，以测定EC50值。显示在与阴性对照(在没有α-MSH的存在下的缓冲液空白)相同范围内蓄积的肽在测试浓度下无效。如果当测定中也存在a-MSH时存在cAMP抑制，则将显示减弱的蓄积的肽视为拮抗剂。类似的测定可以使用hMC-1R、hMC-3R和hMC-5R细胞进行。

使用β-半乳糖苷酶(β-Gal)报道系统的cAMP蓄积测量：

应用使用具有β-半乳糖苷酶(β-Gal)作为功能报道系统的酶片段互补(EFC)系统的化学发光读出系统。用于不同黑皮质素受体系统的这种测定系统是商购的(cAMP HunterGPCR测定系统，Discoverx Corp，Fremont，CA)。该测定法使用分裂成两个互补部分的β-Gal酶；用于酶受体的EA和用于酶供体的ED。在该测定法中，形成与cAMP融合的ED部分以便与由细胞生成的cAMP竞争性结合cAMP-特异性抗体。然后添加EA以便与任何未结合的ED-cAMP形成活性β-Gal。然后这种活性酶将化学发光底物转化成输出信号，其被记录在标准微量培养板读出器上。

简言之，将每个孔10000个细胞铺板过夜，然后在37℃将每个孔(与10μl测定缓冲液一起温育的细胞)与在细胞测定缓冲液(5μL)中的4X顺序浓度的测试化合物和cAMP抗体试剂(5μL)一起温育30min。然后加入包含ED-cAMP偶合的酶片段和报道底物(Emerald II-Galacton Star，5∶1)的细胞裂解缓冲液(20μL)，在室温温育60min。接下来加入20μL EA β-Gal片段试剂。在室温再温育120min后，通过平板读出器(Envision)测定化学发光，将数据用于计算测试肽的EC50值。

结果如表2中所示。

表2：用于本发明的实施例阳离子多肽类的EC50(nM)值

本发明的离子配合物和药物组合物的制备

实施例1：制剂2A(肽1和mPEG-10,000-一羧酸)的制备

将mPEG-10,000-一羧酸(5.4g)在8.4g水中的混合物加入小瓶。塞住小瓶，密封，在121℃高压灭菌15min，得到均匀澄清粘性溶液。冷却时，将小瓶转入无菌通风橱。打开小瓶，将通过0.2μm滤器预先过滤的肽1的无菌水溶液(在1mL中100mg)与之混合。得到配制的肽，为均匀澄清粘性溶液。HPLC分析测定肽1的浓度为9.9mg/mL。

实施例2：制剂2B(肽1和PEG-10,000-二羧酸)的制备

将mPEG-10,000-二羧酸(2.7g)在2.0g水中的混合物加入小瓶。塞住小瓶，密封，在121℃高压灭菌15min，得到均匀澄清粘性溶液。冷却时，将小瓶转入无菌通风橱。打开小瓶，将通过0.2μm滤器预先过滤的肽1的无菌水溶液(在0.5mL中50mg)与之混合。得到配制的肽，为均匀澄清粘性溶液。HPLC分析测定肽1的浓度为10.8mg/mL。

实施例3：制剂2C(肽1和mPEG-20,000-一羧酸)的制备

将PEG-m20,000-羧酸(1.8g)在3.5g丙二醇-乙醇-水混合物(40：15：45之比v/v)中的混合物加入小瓶。塞住小瓶，密封，在121℃高压灭菌15min，得到均匀澄清粘性溶液。冷却时，将小瓶转入无菌通风橱。打开小瓶，将通过0.2μm滤器预先过滤的肽1的无菌水溶液(在0.5mL中30mg)与之混合。得到配制的肽，为均匀澄清粘性溶液。HPLC分析测定肽1的浓度为6mg/mL。

实施例4：制剂2D(肽1和DPPA钠)的制备

将DPPA钠(302mg)在8.6g 1∶1丙二醇-水混合物中的混合物加入小瓶。塞住小瓶，密封，在121℃高压灭菌15min，得到均匀脂质分散体。冷却时，将小瓶转入无菌通风橱。打开小瓶，将通过0.2μm滤器预先过滤的肽1的无菌水溶液(在1mL中100mg)与之混合。得到配制的肽，为均匀非粘性分散体。HPLC分析测定制剂中肽1的浓度为9.6mg/mL。

实施例5：制剂2E(肽1和硬脂酸钠)的制备

将甘露糖醇(300mg)和硬脂酸钠(165mg)的混合物在小瓶中溶于8.3g水。塞住小瓶，在75℃加热0.5小时，得到澄清溶液。冷却时，加入约400μL 1.0N乙酸以便将pH调整为在6-7范围内。塞住小瓶，密封，在121℃高压灭菌15min。冷却时，将小瓶转入无菌通风橱。打开小瓶，将通过0.2μm滤器预先过滤的肽1的无菌水溶液(在1.0g水溶液中100mg)与之混合。得到配制的肽，为均匀光亮乳白色不透明的非粘性混悬液。HPLC分析测定肽1的浓度为9.7mg/mL。

实施例6：制剂#3B(肽1与硬脂酸钠和mPEG-2,000-DSPE)的制备

将mPEG-2000-DSPE(1.85g)和硬脂酸钠(100.1mg)的混合物在小瓶中溶于10.8mL水。塞住小瓶，在75℃加热1小时。冷却时，加入约240μL乙酸以便将pH调整为在6-7范围内。塞住小瓶，密封，在121℃高压灭菌15min。冷却时，将小瓶转入无菌通风橱。打开小瓶，将通过0.2μm滤器预先过滤的肽1的无菌水溶液(在1.2g中120mg)与之混合。得到配制的肽，为均匀光亮乳白色不透明的非粘性混悬液。HPLC分析测定肽1的浓度为10.1mg/mL。

实施例7：制剂#3C(肽1和DPPA钠和PEG-10,000-二羧酸)的制备

将PEG-10,000-二羧酸(1.68g)和sodium DPPA钠(362.4mg)的混合物在小瓶中溶于9.1mL水。塞住小瓶，密封，在121℃高压灭菌15min，得到均匀乳白色不透明混悬液。冷却时，将小瓶转入无菌通风橱。打开小瓶，将通过0.2μm滤器预先过滤的肽1的无菌水溶液(在1.2g中120mg)与之混合。得到配制的肽，为均匀乳白色不透明的混悬液。HPLC分析测定肽1的浓度为10.6mg/mL。

实施例8：制剂#3D(肽1和DPPA钠和PEG-3,350)的制备

将PEG-3,350(10.8mL水溶液中包含1.8g)和DPPA钠(363mg)的混合物加入到小瓶中。塞住小瓶，密封，在121℃高压灭菌15min，得到均匀乳白色不透明混悬液。冷却时，将小瓶转入无菌通风橱。打开小瓶，将通过0.2μm滤器预先过滤的肽1的无菌水溶液(在1.2g中120mg)与之混合。得到配制的肽，为均匀乳白色不透明的混悬液。HPLC分析测定肽1的浓度为10.1mg/mL。

实施例9：制剂#3E(肽1和DPPA钠、PEG-3,350和CMC钠)的制备

将CMC钠(Av MW 90,000)水溶液(9.0mL中72mg)与PEG-3,350(1.8g)混合。向得到的澄清溶液中加入DPPA钠(216mg)。塞住小瓶，密封，在121℃高压灭菌15min，得到均匀乳白色不透明混悬液。冷却时，将小瓶转入无菌通风橱。打开小瓶，将通过0.2μm滤器预先过滤的肽1的无菌水溶液(在1.2g中120mg)与之混合。得到配制的肽，为均匀乳白色不透明的混悬液。HPLC分析测定肽1的浓度为10.9mg/mL。

实施例10：制剂#3F(肽1和mPEG-2,000-DSPE和CMC钠)的制备

将CMC钠(Av MW 90,000)水溶液(在10.8mL中72mg或6.7mg/mL)与mPEG-2,000-DSPE(1.85g)混合。塞住小瓶，密封，在121℃高压灭菌15min，得到均匀澄清溶液。冷却时，将小瓶转入无菌通风橱。或者，将包含CMC钠和mPEG-2,000-DSPE混合物的小瓶内容物混合过夜，得到澄清溶液，通过0.2μm滤器过滤。在无菌通风橱中打开小瓶，将通过0.2μm滤器预先过滤的肽1的无菌水溶液(在1.2g中120mg)与之混合。得到配制的肽，为均匀澄清溶液。HPLC分析测定肽1的浓度为10.5mg/mL。

实施例11：制剂#4B(肽1和mPEG-2,000-DSPE)的制备

将mPEG-2,000-DSPE(1.855g)和甘露糖醇(181mg)的混合物在小瓶中溶于8.8mL注射用水(充氮气10min)。塞住小瓶，缓慢地旋转以便用水完全湿润所有的固体成分。然后在121℃高压灭菌15min。在该阶段的小瓶内容物为澄清溶液。冷却时，将小瓶转入无菌通风橱。打开小瓶，将通过0.2μm滤器预先过滤的肽1的无菌水溶液(在1.2g中120mg)与之混合1h。得到配制的肽，为均匀澄清溶液。HPLC分析测定肽1的浓度为8.7mg/mL。

实施例12：制剂#4C(肽1和mPEG-2,000-DSPE和CMC)的制备

用冲氮气的注射用水制备8.9mg/mL浓度的CMC钠(Av MW 90,000)水溶液。向在小瓶中的9.8mL该溶液中加入PEG-2,000-DSPE(1.853g)和甘露糖醇(182mg)。塞住小瓶，缓慢地旋转以便用溶剂完全湿润所有的固体成分。然后在121℃高压灭菌15min。在该阶段小瓶的内容物为澄清溶液。冷却时，将小瓶转入无菌通风橱。打开小瓶，将通过0.2μm滤器预先过滤的肽1的无菌水溶液(在1.2g中120mg)与之混合1h。得到配制的肽，为均匀澄清溶液。HPLC分析测定肽1的浓度为8.0mg/mL。

实施例13：制剂#4D(肽1和mPEG-2,000-DSPE和DPPA)的制备

将mPEG-2,000-DSPE(1.86g)、DPPA钠(363mg)和甘露糖醇(60.2mg)的混合物在小瓶中溶于9mL注射用水(充氮气10min)。塞住小瓶，缓慢地旋转以便用水完全湿润所有的固体成分。然后在121℃高压灭菌15min。在该阶段的小瓶内容物为光亮乳白色均匀混悬液。冷却时，将小瓶转入无菌通风橱。打开小瓶，将通过0.2μm滤器预先过滤的肽1的无菌水溶液(在1.2g中120mg)与之混合1h，得到均匀的光亮乳白色不透明非粘性混悬液。HPLC分析测定肽1的浓度为9.2mg/mL。

实施例14：制剂#4E(肽1和mPEG-2,000-DSPE和CMC)的制备

用冲氮气的注射用水制备7.2mg/mL浓度的CMC钠水溶液。向在小瓶中的10mL该溶液中加入mPEG-2,000-DSPE(0.94g)和甘露糖醇(181.7mg)。塞住小瓶，缓慢地旋转以便用溶剂完全湿润所有的固体成分。然后在121℃高压灭菌15min。在该阶段小瓶的内容物为澄清无色溶液。冷却时，将小瓶转入无菌通风橱。打开小瓶，将通过0.2μm滤器预先过滤的肽1的无菌水溶液(在1.2g中120mg)与之混合1h。得到配制的肽，为均匀澄清溶液。HPLC分析测定肽1的浓度为9.6mg/mL。

实施例15：制剂#4F(肽1和mPEG-2,000-DSPE和DPPA)的制备

将mPEG-2,000-DSPE(0.954g)、DPPA钠(183.7mg)和甘露糖醇(61.7mg)的混合物在小瓶中溶于9.6mL注射用水(充氮气10min)。塞住小瓶，缓慢地旋转以便用水完全湿润所有的固体成分。然后在121℃高压灭菌15min。在该阶段的小瓶内容物为光亮乳白色均匀混悬液。冷却时，将小瓶转入无菌通风橱。打开小瓶，将通过0.2μm滤器预先过滤的肽1的无菌水溶液(在1.2g中120mg)与之混合1h，得到均匀的光亮乳白色不透明非粘性混悬液。HPLC分析测定肽1的浓度为9.9mg/mL。

实施例16：具有肽1、mPEG-2,000-DSPE、CMA和D-甘露糖醇的制剂的制备

＊基于肽含量

如下制剂基于10mL制剂且易于按比例缩小至得到上表中的1mL终体积。

将CMC钠(Av MW 90,000)(80mg)和D-甘露糖醇(220mg)的水溶液在带有搅棒和塞子的预称重的小瓶中溶于7ml注射用水。向该溶液中加入固体mPEG-2,000-DSPE钠(1g)。塞住小瓶，密封。将其放入设定在60℃的水浴，搅拌内容物。或者，将小瓶放入维持在60℃的烘箱中。最初小瓶内容物可能浑浊，但在1-2小时内转变成澄清均匀溶液。使小瓶达到室温。然后打开，将肽1的水溶液(1mL中100mg，基于其净肽含量)与之混合。内容物可以即刻变浑浊，但在混合时变成澄清均匀溶液。称重小瓶，通过添加所需量的注射用水将总内容物的重量调整至10.1gm。然后混合得到的制剂，在无菌通风橱中通过0.2μm滤器过滤。得到配制的制剂，为均匀澄清溶液，通过HPLC测定确认肽-1的浓度为10mg/ml。

实施例17：具有肽1、DPPA钠和PEG-3,350的制剂的制备

＊基于肽含量

如下制剂基于10mL制剂且易于按比例缩小至得到上表中的1mL终体积。

在预先称重的带塞的小瓶中加入1.2gm PEG-3350和8mL注射用水。通过混合溶解内容物，加入302mg DPPA钠。塞住小瓶，密封，将其在121℃放入高压灭菌器中高压灭菌15min，得到均匀乳白色不透明混悬液。冷却时，将小瓶转入无菌通风橱。打开小瓶，将预先通过0.2μm滤器过滤的肽1的无菌水溶液(1mL中100mg，基于其净肽含量)与之混合。通过添加适量的注射用水将小瓶的总内容物调整至10-1gm。混合时，得到配制的肽，为均匀乳白色不透明混悬液。通过HPLC测定配制的肽，确认肽-1的浓度为10mg/ml。

实施例18：将制剂施用于猕猴以评价药代动力学

将一组猕猴(平均体重范围在3-7kg)随机分入上述每种制剂和制剂3A的6只的组。给组中的每只猴子在肩域经皮下施用快速浓注单剂量的以0.5mg/kg体重计算的制剂。在施用后从30分钟开始至36或48小时的不同时间点取血样。采集血浆，使用LC-MS/MS技术测定肽药物浓度。药代动力学数据如下表3中所示，以图示方式在图1、图2和图3中举出药代动力学特性。

表3：制剂的药代动力学数据(N＝6；剂量＝0.5mg/Kg，对照制剂包含在柠檬酸盐缓冲液中的肽1)

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＊％Fr表示与对照4A比较时制剂的生物利用度。

正如从与示例性的肽-1的离子配合物的对比药代动力学研究中显而易见的，C-max显著减小(1100ng/mL的肽1Cmax与使用配合物3D观察到的228ng/mL)。本发明的许多另外的离子配合物与肽-1相比展示出类似范围的减弱的C-max。除此之外，T-max在使用几种这些离子配合物时也显著增加(肽-1的T-max为0.5hrs与使用许多所述离子配合物的几小时的T-max)。

将本文引述的所有专利、公布的申请和其中引述的参考文献完整地引入本文作为参考。

尽管具体显示并且参照其实施例实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员可以理解，可以在不脱离由待批权利要求涵盖的本发明范围的情况下对其中进行各种形式和内容上的各种改变。