豨莶草水提物在制备改善心肌再灌注损伤药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种豨莶草水提物的用途，特别是涉及豨莶草水提物在制备改善心肌再灌注损伤药物中的应用。

背景技术

心肌再灌注(myocardial reperfusion,MR)损伤是急性冠脉综合征患者在介入治疗后出现心脏事件的病理基础，是严重威胁民众健康的临床难题。防治再灌注引起的心肌损伤，对于减少介入后的心脏事件具有重要的临床意义。目前，临床上应用钙拮抗剂、腺苷受体激动剂、改善能量代谢药以及缺血后适应处理手段探索性地治疗介入后的MR损伤，能在一定程度减轻心肌损伤，但是由于作用靶点单一，尚不能取得满意的临床疗效。

豨莶草(Herba siegesbeckiae，HS)为菊科植物豨莶Siegesbeckia orientalisL.、腺梗豨莶Siegesbeckia pubescens Makino或毛梗豨莶Siegesbeckia glabrescensMakino的干燥地上部分，是我国传统中草药，用药历史悠久。豨莶草性寒味苦，2020年版《中国药典》记载，豨莶草具有祛风湿，利关节，解毒之效，主要用于风湿痹痛，筋骨无力，腰膝酸软，四肢麻痹，半身不遂，风疹湿疮。

豨莶草的主要化学成分有二萜类、倍半萜类、黄酮类和其他类。现代药理学研究证实，豨莶草具有显著的抗炎和调节免疫作用。现代医学将类风湿性关节炎(Rheumatoidarthritis，RA)归结为多发性自身免疫性疾病，与中医的“痹证”相似，通过现代实验研究证实豨莶草水提物能有效对抗单克隆抗体组合诱导的RA。豨莶草水提物是否能够改善大鼠心肌再灌注损伤，其改善再灌注损伤的药效药理学作用尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供豨莶草水提物在制备改善心肌再灌注损伤药物中的应用。

本发明的技术方案概述如下：

豨莶草水提物在制备改善心肌再灌注损伤药物中的应用。

豨莶草水提物的制备，优选下述方法：

按比例，将1g豨莶草加8-10ml水浸泡20-40min，煮沸20-30min，过滤，再向滤渣中加入5-7ml水，煮沸20-30min，过滤，合并滤液，加热浓缩成相当于豨莶草生药1g/ml的水煎液，即为豨莶草水提物。

以水为提取媒介的各种提取方法(如包括超声提取、回流提取、冷浸提取、微波提取)提取获得的豨莶草水提物也可以用于本发明。

本发明的优点：

(1)实验证明，豨莶草水提物能显著改善大鼠心肌再灌注损伤引起的线粒体呼吸链复合体活性，减少活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生，抑制氧化应激。

(2)豨莶草水提物能显著抑制大鼠心肌再灌注损伤引起的NLRP3炎症小体激活，减轻炎症反应。

(3)豨莶草水提物能显著减轻大鼠心肌再灌注引起的心肌损伤酶谱改变，恢复心肌组织形态结构。

(4)豨莶草水提物能显著减轻大鼠心肌再灌注引起的心肌梗死，改善心肌再灌注损伤。

附图说明

图1为豨莶草水提物对大鼠心肌再灌注引起的氧化应激水平和线粒体呼吸链复合体活性的影响。

图2为豨莶草水提物对大鼠心肌再灌注引起的血浆炎症因子含量和NLRP3炎症小体水平的影响。

图3为豨莶草水提物对大鼠心肌再灌注引起的心肌损伤酶谱和心肌组织形态结构的影响。

图4为豨莶草水提物对大鼠心肌再灌注引起的心肌梗死面积的影响。

具体实施方式

本发明所应用的豨莶草为菊科植物豨莶Siegesbeckia orientalis L.

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

豨莶草水提物的制备，包括如下步骤：

按比例，将1g豨莶草加9ml水浸泡30min，煮沸25min，过滤，再向滤渣中加入6ml水，煮沸25min，过滤，合并滤液，加热浓缩成相当于豨莶草生药1g/ml的水煎液，即为豨莶草水提物。

实施例2

豨莶草水提物的制备，包括如下步骤：

按比例，将1g豨莶草加8ml水浸泡40min，煮沸20min，过滤，再向滤渣中加入7ml水，煮沸20min，过滤，合并滤液，加热浓缩成相当于豨莶草生药1g/ml的水煎液，即为豨莶草水提物。

实施例3

豨莶草水提物的制备，包括如下步骤：

按比例，将1g豨莶草加10ml水浸泡20min，煮沸30min，过滤，再向滤渣中加入5ml水，煮沸30min，过滤，合并滤液，加热浓缩成相当于豨莶草生药1g/ml的水煎液，即为豨莶草水提物。

实施例4

大鼠心肌再灌注损伤模型的建立方法，包括如下步骤：

(1)用2％戊巴比妥钠(60mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠；

(2)用16G静脉留置针气管插管，接小动物呼吸机；

(3)在大鼠3-4肋间开胸暴露心脏，在左心耳与肺动脉圆锥交叉点以下2mm处，用3/8弯针结扎冠状动脉左前降支(left anterior descending coronary artery,LADCA)；

(4)30min后解开结扎线形成再灌注损伤。

实施例5

将实施例1制备的豨莶草水提物加水分别稀释成0.25g/ml和0.5g/ml的稀释液。

分组与给药，药物均为实施例1制备，包括如下步骤：

(1)将雄性SD大鼠(240±10g，100只)，随机分成

假手术组(Sham)、

再灌注组(MR)、

豨莶草低剂量组(HS 1g/kg+MR，简称HS1+MR)、

豨莶草中剂量组(HS 2g/kg+MR，简称HS2+MR)和

豨莶草高剂量组(HS 4g/kg+MR，简称HS4+MR)，

每组20只(各组检测指标所用动物数详见表1)。

Sham组手术时LADCA仅穿线不结扎。

豨莶草给药组从术前7天开始灌胃给药，每日1次，持续7日，第7日给药1h后，制作心肌再灌注损伤模型，Sham组和MR组连续7天灌胃给予同等体积的生理盐水。

(2)再灌注后2h检测各组氧化应激水平、线粒体呼吸链复合体活性、炎症因子含量、NLRP3炎症小体水平、心肌损伤酶谱、心肌组织形态结构及心肌梗死。

表1实验各组大鼠检测指标所用动物数

实施例6

豨莶草水提物对大鼠心肌再灌注引起的氧化应激水平和线粒体呼吸链复合体活性的影响。

实验材料

1.试剂：肝素、大鼠活性氧簇(ROS)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒(DG21175D)、大鼠超氧化物歧化酶(SOD)ELISA检测试剂盒(DG20033D)、大鼠锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)ELISA检测试剂盒(DG21155D)、大鼠8羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)ELISA检测试剂盒(DG20090D)、大鼠线粒体呼吸链复合体Ⅰ(ComplexⅠ)ELISA检测试剂盒(DG21009D)、大鼠线粒体呼吸链复合体Ⅱ(ComplexⅡ)ELISA检测试剂盒(DG21011D)、大鼠线粒体呼吸链复合体Ⅳ(ComplexⅣ)ELISA检测试剂盒(DG21054D)、大鼠线粒体呼吸链复合体Ⅴ(ComplexⅤ)ELISA检测试剂盒(DG21056D)，ELISA检测试剂盒均购自北京冬歌博业生物科技有限公司。

2.仪器：37℃恒温恒湿箱、酶标仪(MULTISKAN MK3,Thermo,USA)。

实验方法

ELISA检测各组血浆ROS活性与SOD的含量，及心肌组织8-OHdG的含量与Mn-SOD、ComplexⅠ/Ⅱ/Ⅳ/Ⅴ的活性。

(1)血浆样本收集与处理

各组大鼠在再灌注2h，用肝素作为抗凝剂从腹主动脉采集全血，并将标本在采集后的30分钟内于4℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测。

(2)心肌组织样本收集与处理

各组大鼠在再灌注2h，开胸取心脏，用预冷的PBS(0.01M,pH＝7.4)冲洗组织，去除残留血液(匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果)，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5～10分钟，取上清检测。

(3)ELISA操作步骤

①试剂盒从冷藏环境中取出在室温平衡；

②从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需微孔酶板条；

③设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

④样本孔中加入待测样本50μL，空白孔不加；

⑤除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃恒温恒湿箱温育60min。

⑥弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(350μL)，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；

⑦每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min；

⑧每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

(4)实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

实验结果

1.各组大鼠氧化应激水平如表2所示。

表2实验各组大鼠氧化应激水平

注：

由表2的结果可知，与Sham组相比，MR能显著升高血浆ROS活性(图1A)和心肌组织8-OHdG含量(图1B)，显著降低血浆SOD含量(图1C)和心肌组织MnSOD(图1D)的活性；而本发明实施例1的豨莶草水提物连续7天预防给药能显著降低MR大鼠血浆ROS的活性与心肌组织8-OHdG的含量，显著提高MR大鼠血浆SOD含量与心肌组织MnSOD的活性；该结果表明豨莶草水提物能显著抑制大鼠MR导致的氧化应激。

2.各组大鼠线粒体呼吸链复合体活性如表3所示。

表3实验各组大鼠线粒体呼吸链复合体活性

注：

由表3的结果可知，与Sham组相比，MR组大鼠心肌组织线粒体呼吸链复合体ComplexⅠ/Ⅱ/Ⅳ/Ⅴ的活性显著降低(图1E-1F)；而本发明实施例1的豨莶草水提物连续7天预防给药能显著抑制MR导致的线粒体呼吸链复合体ComplexⅠ/Ⅱ/Ⅳ/Ⅴ的活性降低(图1E-1F)；该结果提示豨莶草水提物抑制MR导致的氧化应激可能与其提高线粒体呼吸链复合体的活性有关。

实施例7

豨莶草水提物对大鼠心肌再灌注引起的血浆炎症因子含量和NLRP3炎症小体水平的影响。

实验材料

1.试剂：肝素，大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA检测试剂盒(DG20065D)、白细胞介素-1β(IL-1β)ELISA检测试剂盒(DG20049D)、白细胞介素-6(IL-6)ELISA检测试剂盒(DG94490Q)、IL-18ELISA检测试剂盒(DG20088D)、大鼠半胱氨酸蛋白酶1(Caspase-1)ELISA检测试剂盒(DG95814Q)，ELISA试剂盒均购自北京冬歌博业生物科技有限公司；RIPA蛋白提取液、蛋白酶抑制剂、BCA蛋白定量试剂盒、NLRP3抗体(ab263899,abcam)、ASC抗体(ab180799,abcam)、GSDMD抗体(39754s,CST)。

2.仪器：37℃恒温恒湿箱、酶标仪(MULTISKAN MK3,Thermo,USA)。

实验方法

1.ELISA检测各组大鼠血浆TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18的含量，及心肌左心室组织caspase-1的活性。

(1)血浆样本收集与处理

各组大鼠在再灌注2h，用肝素作为抗凝剂从腹主动脉采集全血，并将标本在采集后的30分钟内于4℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测。

(2)心肌组织样本收集与处理

各组大鼠在再灌注2h，开胸取心脏，用预冷的PBS(0.01M,pH＝7.4)冲洗组织，去除残留血液(匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果)，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5～10分钟，取上清检测。

(3)ELISA操作步骤

①试剂盒从冷藏环境中取出在室温平衡；

②从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需微孔酶板条；

③设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

④样本孔中加入待测样本50μL，空白孔不加；

⑤除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃恒温恒湿箱温育60min。

⑥弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(350μL)，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；

⑦每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min；

⑧每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

(3)实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

2.蛋白免疫印迹分析(Western Blotting)检测各组大鼠左心室梗死边缘区NLRP3、ASC和GSDMD的表达。

(1)大鼠心肌组织蛋白提取

取各组大鼠左心室梗死边缘区心肌组织，按照10％加入预冷的含有蛋白酶抑制剂的RIPA蛋白提取液进行匀浆，13000rpm，4℃，离心20min，取上清即为心肌组织全蛋白。

(2)BCA法蛋白定量

①根据样品数量，将试剂A：B＝50:1配制适量BCA工作液，充分混匀。

②完全溶解蛋白标准品，取10μl稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。

③将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加至96孔板的标准品孔中，并用标准品稀释液补足20μl。

④将待测样品滴加至样品孔中，用标准品稀释液补足20μl。

⑤各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30min。

⑥测定A570nm，绘制标准曲线图并计算蛋白浓度。

(3)Western Blotting实验步骤

①配胶：配制10％分离胶，5％浓缩胶。

②上样：将待检测蛋白样品按照40μg/孔加入相应蛋白泳道。

③电泳：浓缩胶恒压80V，约40min；分离胶恒压100V，通过预染蛋白marker来确定电泳停止时间。

④电转：湿转法，转膜条件：250mA恒流；0.45μm孔径PVDF膜，转膜时间120min。

⑤封闭：将膜完全浸没于5％BSA-TBST中，水平摇床室温孵育60min。

⑥一抗孵育：5％BSA-TBST稀释一抗，水平摇床4℃孵育过夜。

⑦洗膜：次日，TBST洗3次，每次10min。

⑧二抗孵育：5％BSA-TBST稀释二抗，山羊抗兔IgG(H+L)HRP 1:10000，室温孵育60min。

⑨洗膜：TBST洗膜3次，每次10min。

⑩曝光：ECL滴加到膜的蛋白面，反应3min，曝光(时间随不同光强度而调整)。

11结果分析：用Quantity One软件检测蛋白条带灰度，以目的蛋白与GAPDH的灰度值比作为蛋白的相对表达量，每组至少使用4个样本，并重复3次，取每次实验的蛋白相对表达量与Sham组的比值作为统计结果。

实验结果

1.各组大鼠血浆中炎症因子的含量如表4所示。

表4实验各组大鼠血浆炎症因子的含量

注：

由表4的结果可知，与Sham组相比，MR能显著升高血浆炎症因子TNF-α(图2A)、IL-1β(图2B)、IL-6(图2C)、IL-18(图2D)的含量，而本发明实施例1的豨莶草水提物连续7天预防给药可以降低MR大鼠血浆炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18的含量，其中，高剂量的豨莶草水提物(4g/kg)降低效果最明显，与MR组相比，有显著统计学差异。该结果表明豨莶草水提物能显著抑制大鼠MR引起的炎症反应。

2.各组大鼠NLRP3炎症小体水平如表5所示。

表5实验各组大鼠NLRP3、ASC和GSDMD的蛋白表达与Caspase-1的活性

注：

由表5的结果可知，与Sham组相比，MR能显著提高左心室梗死边缘区心肌组织NLRP3、ASC和GSDMD的表达(图2E-2F)，及Caspase-1的活性(图2G)，而本发明实施例1的豨莶草水提物连续7天预防给药可以抑制MR引起的NLRP3、ASC和GSDMD表达升高及Caspase-1活性增强；从统计结果可见，高剂量的豨莶草水提物(4g/kg)抑制NLRP3炎症小体的效果最明显，与MR组相比，各个指标均有显著统计学差异。该结果表明大鼠MR损伤能显著激活NLRP3炎症小体，而豨莶草水提物能显著抑制大鼠MR引起的NLRP3炎症小体的激活，减轻炎症反应。

实施例8

豨莶草水提物对大鼠心肌再灌注引起的心肌损伤酶谱指标和心肌组织形态结构的影响。

实验材料

1.试剂：肝素、大鼠肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)ELISA检测试剂盒(DG20068D)、大鼠心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)ELISA检测试剂盒(DG96089Q)、大鼠乳酸脱氢酶(LDH)ELISA检测试剂盒(DG20067D)、大鼠丙二醛(MDA)ELISA检测试剂盒(DG20032D)，ELISA检测试剂盒均购自北京冬歌博业生物科技有限公司。

2.仪器：37℃恒温恒湿箱、酶标仪(MULTISKAN MK3,Thermo,USA)。

实验方法

1.ELISA检测各组血浆CK-MB、cTnT和LDH的含量，及心肌组织MDA的含量。

(1)血浆样本收集与处理

各组大鼠在再灌注2h，用肝素作为抗凝剂从腹主动脉采集全血，并将标本在采集后的30分钟内于4℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测。

(2)心肌组织样本收集与处理

各组大鼠在再灌注2h，开胸取心脏，用预冷的PBS(0.01M,pH＝7.4)冲洗组织，去除残留血液(匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果)，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5～10分钟，取上清检测。

(3)ELISA操作步骤

①试剂盒从冷藏环境中取出在室温平衡；

②从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需微孔酶板条；

③设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

④样本孔中加入待测样本50μL，空白孔不加；

⑤除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃恒温恒湿箱温育60min。

⑥弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(350μL)，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；

⑦每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min；

⑧每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

(4)实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

2.心肌组织形态结构观察

在再灌注2小时，开胸取大鼠心脏，用4％多聚甲醛固定48h，经50％-70％-80％-95％-100％乙醇逐级脱水，二甲苯透明、浸蜡、包埋，最后制成5μm厚的连续石蜡切片。石蜡切片脱蜡至水，经常规苏木精-伊红(HE)染色，中性树胶封片，光学显微镜观察拍照。

实验结果

1.各组大鼠心肌损伤酶谱指标如表6所示。

表6实验各组大鼠心肌损伤酶谱指标

注：

由表6的结果可知，与Sham组相比，MR组血浆CK-MB(图3A)、cTnT(图3B)、LDH(图3C)、心肌组织MDA含量(图3D)显著升高；而本发明实施例1的豨莶草水提物连续7天预防给药能显著降低MR引起的血浆CK-MB、cTnT、LDH、心肌组织MDA的含量升高；该结果表明豨莶草水提物能显著抑制大鼠MR导致的心肌损伤。

2.各组大鼠心肌组织形态结构变化。

如图3E所示，上图是在×1物镜条件下拍摄的图像，下图是在×40物镜条件下拍摄的图像。与Sham组相比，MR引起大鼠心肌纤维排列紊乱、断裂和心肌组织水肿等明显的形态学损伤，而豨莶草水提物能减轻MR引起的心肌损伤，恢复心肌组织结构。

实施例9

豨莶草水提物对大鼠心肌再灌注引起的心肌梗死面积的影响。

实验材料

(1)试剂：伊文思兰(Evans blue)、氯化三苯基四氮唑(TTC)。

(2)仪器：37℃恒温恒湿箱。

实验方法

(1)心肌组织Evans blue-TTC染色

①再灌注2h后，重新结扎冠状动脉左前降支，由股静脉快速推注4％Evans Blue2ml；

②打开胸腔，取出心脏，从心尖部向结扎线的方向，将心脏横切成1mm厚的5个薄片；

③将5个薄片放入0.375％的TTC染液中，37℃孵育15min；

④用连有Digital sight(DS-5M-U1，NIKON，Nanjing，China)的解剖镜拍摄心脏薄片，其中，梗死区被染成白色，缺血区为白色+红色，非缺血区呈蓝色。

(2)心肌梗死面积测定

用Image-Pro plus 6.0(Media Cybernetic,Bethesda,MD,USA)图像分析软件测量每个薄片中梗死区面积(Infarct area)、缺血区面积(area at risk,AAR)和左心室面积(left ventricle,LV)。计算5个薄片缺血区面积与左心室面积百分比的均值AAR/LV(％)；计算5个薄片梗死区面积与缺血区面积百分比的均值Infarct area/AAR(％)，用来表示心肌梗死的程度。

实验结果

各组大鼠AAR/LV与Infarct area/AAR结果如表7所示。

表7实验各组大鼠心肌缺血与左心室面积比、及心肌梗死与缺血区面积比

注：

图4A显示的是各组大鼠心肌组织Evans blue-TTC染色图，其中白色代表梗死区，白色与红色共同代表缺血区，蓝色表示非缺血区。由表7的结果可知，与Sham组相比，再灌注2h，MR组和豨莶草三个剂量给药组的AAR/LV显著增加(图4B)，而豨莶草给药组与MR组之间没有显著差异，说明MR组和豨莶草给药组的缺血面积一致；与Sham组相比，MR组和豨莶草三个剂量给药组的Infarct area/AAR均显著增加(图4C)，而与MR组相比，本发明实施例1的豨莶草水提物连续7天预防给药能显著降低Infarct area/AAR，豨莶草4g/kg的效果最显著；该结果表明豨莶草水提物能显著减轻大鼠MR导致的心肌梗死。

实验证明，实施例2、3制备的豨莶草水提物也能显著抑制大鼠心肌再灌注损伤引起的氧化应激和炎症反应。豨莶草水提物能显著减轻大鼠心肌再灌注引起的心肌损伤和心肌梗死，改善心肌再灌注损伤。