一种抗菌促修复的水凝胶复合材料及其制备和应用

技术领域

本发明涉及纳米复合材料技术领域，尤其是涉及一种抗菌促修复的水凝胶复合材料及其制备和应用。

背景技术

伤口愈合的过程通常很难完美有序地进行，各种因素在任何阶段的影响都可能导致伤口修复异常，如过度炎症、烧伤、大面积皮肤组织丢失、感染或者糖尿病等，处理延迟或不当而引发的一系列细菌感染使得伤口难以愈合或者增加患败血症的风险。临床上抗生素的大量使用，会引起严峻的细菌耐药性问题，因此开发更好的抗菌策略尤为重要。近年来，水凝胶独特的三维多孔结构和良好的生物相容性得到研究者们的极大关注，与其他类型的创面治疗材料相比，水凝胶作为伤口敷料，尤其是壳聚糖类水凝胶具有良好的吸水性，能够吸附渗出物并使伤口环境保持湿润有助于组织细胞的迁移和增殖，形成物理屏障防止微生物污染，并且还具有一定的止血、抗菌、消炎以及促进创面愈合的功能。但单纯的壳聚糖类水凝胶机械性能差，不足以使创面短时间内修复。通过修饰并装载纳米药物制备多功能水凝胶，在特定的微环境中控制药物的释放，以促进细胞增殖和杀灭细菌。目前，研究者开发出很多具有抗菌、抗炎特性的生物纳米材料，例如Zn、Cu、Ag和Ce等复合物在生物医学领域被广泛应用。因此，开发智能水凝胶平台实现协同抗菌抗炎促修复，这对提高创面愈合效果是有广阔发展前景的。

氧化锌纳米颗粒(ZnO-NPs)作为目前应用非常广泛的无机抗菌材料，可以直接作用并破坏细胞壁，导致内容物流出从而杀灭细菌。在细菌感染微环境的微酸性条件下ZnO-NPs迅速解离出Zn

公开专利号CN112076339B公开了一种含氧化锌纳米颗粒的抗菌创可贴及其制备方法，该发明所制备的创可贴由黏性背衬、药物层、壳聚糖无纺布层和可剥离层组成。壳聚糖无纺布层上含有通过浸渍法连接上的纳米级氧化锌，药物层上附着有含有中药成分的药剂，该药剂包含小蓟提取物、壳聚糖季铵盐、生长因子、氨基酸和复合维生素等成分。但该创可贴无法对pH作出响应，且仅适用于于皮肤创伤较为表浅，伤口不宽、出血不多且不用缝合的伤口。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种抗菌促修复的水凝胶复合材料及其制备和应用，本发明的水凝胶复合材料对pH做出响应，且具有较好的机械强度、粘附能力以及较短的创面愈合时间，能够实现对创面的抗菌抗炎促修复效果。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明提供一种抗菌促修复的水凝胶复合材料的制备方法，包括以下步骤：

S1：制备ZnO-NCs：将二水合乙酸锌(Zn(AC)

S2：制备ZC-NCs：将步骤S1所得ZnO-NCs与六水合硝酸铈(Ce(NO

S3：制备ZC-QPP水凝胶：将步骤S2所得ZC-NCs制备成ZnO@CeO

进一步的，在步骤S1中，所述Zn(AC)

进一步的，在步骤S1中，所述Zn(AC)

进一步的，在步骤S1中，所述NaOH有机溶液中所用溶剂包括甲醇、乙醇、丙醇中的一种或多种。更进一步的，为甲醇。

进一步的，在步骤S1中，所述加水搅拌的时间为5～15min。

进一步的，在步骤S1中，所述反应的时间为20～40min。

进一步的，在步骤S1中，进一步的，在步骤S1中，所述洗涤所用洗涤剂包括甲醇、乙醇、丙醇、甲酮、乙酮、丙酮中的一种或多种。更进一步的，为乙醇和丙酮混合溶液。

进一步的，在步骤S1中，所述洗涤次数为2～5次。

进一步的，在步骤S1中，所述ZnO-NCs粒径为50～120nm。

进一步的，将步骤S1制备得到的ZnO-NCs置于有机溶剂中保存。更进一步的，所述有机溶剂为乙醇。

进一步的，在步骤S2中，所述ZnO-NCs与Ce(NO

进一步的，在步骤S2中，所述氨水中NH

进一步的，在步骤S2中，所述氨水体积与Ce(NO

进一步的，在步骤S2中，所述加入氨水反应时间为1～3h，温度为30～50℃。

进一步的，在步骤S2中，所述洗涤所用洗涤剂包括甲醇、乙醇、丙醇中的一种或多种。更进一步的，为乙醇。

进一步的，在步骤S2中，洗涤次数为1～5次，温度为室温。

进一步的，将步骤S2制备得到的ZC-NCs置于有机溶剂中保存。更进一步的，所述有机溶剂为乙醇。

进一步的，在步骤S3中，所述交联剂为硼酸(H

进一步的，在步骤S3中，所述QCS、PVA、PEG、H

进一步的，在步骤S3中，所述ZC水溶液的浓度为0.5～15mg/mL，更进一步的，为4～11mg/mL。

进一步的，在步骤S3中，所述混合反应和交联反应温度为室温。

进一步的，在步骤S3中，所述混合反应时间为5～20min。

进一步的，在步骤S3中，所述交联反应时间为12～36h。

本发明还提供一种抗菌促修复的水凝胶复合材料，其由上述制备方法制备得到，具有抗菌促修复功能。

本发明还提供一种抗菌促修复的水凝胶复合材料的应用，用于制备创伤治疗药物，在生物医学领域有广阔的临床应用前景。

与现有技术相比，本发明以下优点：

(1)本发明将合成的ZC-NCs引入到通过氢键与硼酸酯键双交联的QCS/PVA/PEG(QPP)水凝胶结构中，制备得到ZnO@CeO2-QCS/PVA/PEG(ZC-QPP)水凝胶，可对pH做出相应，实现对创面的抗菌抗炎促修复效果，具有抗菌和促创面修复双重效应。

(2)本发明的ZC-QPP水凝胶敷在创面处时，首先形成了物理屏障并为伤口提供了湿润环境。随后，QPP水凝胶在细菌微环境的酸性条件响应下由于动态共价键-硼酸酯键断裂而逐渐降解，ZC-NCs暴露在酸性环境，Zn

(3)本发明的复合材料中的QCS可生物降解，且降解产物无毒无害，生物相容性好，应用于QPP水凝胶时具有优异的抗菌作用和促修复作用；具有双交联的QPP水凝胶形成了网络结构，能够增加凝胶的机械强度和粘附能力。QPP水凝胶一方面能够作为屏障保护伤口并提供湿润的环境，另一方面QCS组分发挥抗菌作用。

(4)本发明的合成制备方法较为简单，合成的ZC-QPP水凝胶粘性好，能够很好的粘附在创面。

附图说明

图1为实施例1制备得到ZC-NCs的透射电镜(TEM)图像；

图2为实施例1制备得到ZC-NCs的元素分布(EDS)图；

图3为实施例1制备得到的ZC-QPP水凝胶和对比例1制备得到的QPP水凝胶的外观图；

图4为实施例1制备得到ZC-NCs对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)的消除效果；

图5为实施例1制备得到各材料和对比例1制备得到的QPP水凝胶的抗菌性能效果图(a)大肠杆菌，(b)金黄色葡萄球菌；

图6为实施例1制备得到各材料和对比例1制备得到的QPP水凝胶的抗金黄色葡萄球菌促修复效果图；

图7为实施例1制备得到各材料和对比例1制备得到的QPP水凝胶的pH响应测试结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

以下各实施例中，QCS取代度为95％，购自上海麦克林生化科技有限公司；PVA平均分子量为58000，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；PEG平均分子量为2000，购自国药集团化学试剂有限公司；DPPH分析纯，纯度为96％，购自上海麦克林生化科技有限公司；甲醇质量浓度为37％，购自上海麦克林生化科技有限公司。

以下各实施例中，如无特别说明的原料或处理技术，则表明其均为本领域的常规市售原料或常规处理技术。

实施例1

一种抗菌促修复的水凝胶复合材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备ZnO-NCs

称取1.98g的Zn(AC)

(2)制备ZC-NCs

将70mg步骤(1)合成的ZnO-NCs与70mg Ce(NO

(3)制备ZC-QPP水凝胶

称取步骤(2)所得ZC-NCs倒入水中，制备得到7.5mg/mL的ZC水溶液，取2mL ZC水溶液，向其中加入200mg QCS超声至充分分散，加入1.5mL 80mg/mL PVA水溶液，搅拌30min后将110mg PEG溶于0.5mL水中并加入到上述溶液中，搅拌10min。向溶液中滴加400μL 35mg/mL H

实施例2

与实施例1相比，绝大部分都相同，除了步骤(1)中Zn(AC)

实施例3

与实施例1相比，绝大部分都相同，除了步骤(1)中Zn(AC)

实施例4

与实施例1相比，绝大部分都相同，除了步骤(2)中ZnO-NCs质量调整为35mg，即ZnO-NCs与Ce(NO

实施例5

与实施例1相比，绝大部分都相同，除了步骤(2)中ZnO-NCs质量调整为105mg，即ZnO-NCs与Ce(NO

实施例6

与实施例1相比，绝大部分都相同，除了步骤(2)中氨水体积调整为350μL，即氨水体积与Ce(NO

实施例7

与实施例1相比，绝大部分都相同，除了步骤(2)中氨水体积调整为1050μL，即氨水体积与Ce(NO

实施例8

与实施例1相比，绝大部分都相同，除了步骤(3)中QCS质量调整为75mg，即QCS、PVA、PEG、H

实施例9

与实施例1相比，绝大部分都相同，除了步骤(3)中QCS质量调整为300mg即QCS、PVA、PEG、H

实施例10

与实施例1相比，绝大部分都相同，除了步骤(3)中PVA水溶液浓度调整为50mg/mL，即QCS、PVA、PEG、H

实施例11

与实施例1相比，绝大部分都相同，除了步骤(3)中PVA水溶液浓度调整为150mg/mL，即QCS、PVA、PEG、H

实施例12

与实施例1相比，绝大部分都相同，除了步骤(3)中PEG质量调整为75mg，，即QCS、PVA、PEG、H

实施例13

与实施例1相比，绝大部分都相同，除了步骤(3)中PEG质量调整为225mg，，即QCS、PVA、PEG、H

实施例14

与实施例1相比，绝大部分都相同，除了步骤(3)中H

实施例15

与实施例1相比，绝大部分都相同，除了步骤(3)中H

实施例16

与实施例1相比，绝大部分都相同，除了步骤(3)中ZC水溶液浓度调整为0.5mg/mL。

实施例17

与实施例1相比，绝大部分都相同，除了步骤(3)中ZC水溶液浓度调整为15mg/mL。

对比例1

取2mL水溶液，向其中加入200mg QCS超声至充分分散，加入1.5mL 80mg/mL PVA水溶液，搅拌30min后将110mg PEG溶于0.5mL水中并加入到上述溶液中，搅拌10min。向溶液中滴加400μL 35mg/mL H

性能测试：

一、TEM测试和EDS分析

对实施例1步骤(2)得到的ZC-NCs进行透射电镜测试和能谱分析，结果从图1和图2可知，ZC-NCs的粒子边缘分布清晰，ZC-NCs的元素分布图中O、Zn、Ce元素的均匀分布，说明成功合成ZC-NCs，且分散性较好。

二、粘性分析

对实施例1步骤(3)得到的ZC-QPP水凝胶外观和对比例1得到的QPP水凝胶进行对比分析，结果由图3可知，ZC-NCs在凝胶中分散良好，具有良好的粘性。这是因为QPP水凝胶结构通过PVA与硼酸交联形成动态硼酸酯键，同时体系中存在大量的氢键，使得凝胶粘性增大。此外，在生理条件下QCS分子中的季铵盐基团可以通过静电作用吸附在组织表面，并使QCS中的伯胺基团和凝胶中存在的羟基与组织表面的羧基共价结合。

三、ZC-NCs活性氧消除效果测试

对实施例1步骤(2)得到的ZC-NCs进行活性氧消除效果测试，测试方法如下：

测试方法：首先配置0.05mg/mL的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)乙醇溶液，置于避光环境。之后将步骤(2)得到的ZC-NCs配置成不同浓度的ZC水溶液，分别为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mg/mL。取1mL与1mL乙醇、1mLDPPH乙醇溶液混合，为实验组。由于本次实验只采用ZC水溶液进行活性氧消除效果测试，未添加QCS、PVA、PEG、H

设置空白组，不添加ZC水溶液，为2mL乙醇与1mLDPPH乙醇溶液混合。

实验组和空白组置于黑暗环境、室温条件下摇床震荡孵育30min。之后，离心吸取上清液，使用紫外-可见光谱仪测定DPPH在517nm处的特征吸光度，DPPH清除率公式如下，其中空白组(DPPH+乙醇)的吸光度记为A

DPPH清除率(％)＝(A

测试结果：如图4所示，随着ZC-NCs浓度的不断增大，DPPH乙醇溶液的吸光度呈显著下降趋势，表现出明显的浓度依赖性。并且1mg/mL的ZC-NCs对DPPH的消除率达到55％，证明了ZC-NCs较优异的抗氧化能力，即ZC-NCs对活性氧具有优异的消除效果。

四、抗菌性能效果测试和抗菌促修复效果测试

对实施例1制备得到的ZnO-NCs、ZC-NCs、ZC-QPP水凝胶和对比例1制备得到的QPP水凝胶进行抗菌性能效果测试。

测试方法：使用革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)来进行抗菌实验。将琼脂培养基上的大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)转移到已灭菌的Luria Bertani(LB)培养基，置于摇床中(180rpm，37℃)培养24小时。随后，通过离心收集菌落并用LB培养基将菌液稀释至3×10

将ZnO-NCs配置成浓度为10mg/mL的ZnO水溶液，作为ZnO组；将ZC-NCs配置成浓度为10mg/mL的ZC水溶液，作为ZC组，将ZC-QPP水凝胶作为ZC-QPP水凝胶组，将QPP水凝胶作为QPP水凝胶组，将0.1mol/L磷酸(PB)缓冲溶液作为对照组，分别取2mL的材料水溶液或0.54g水凝胶分别与20mL稀释后的菌液在37℃下共孵育。1小时后，离心收集细菌并用4％甲醛溶液固定。用乙醇溶液对处理过的细菌进行脱水处理，最后在扫描电子显微镜下观察细菌的形态。

测试结果：如图5所示，ZC-QPP水凝胶通过静电吸附作用改变了细胞膜通透性，导致细菌内容物泄漏，使细菌死亡。另一方面，ZnO组分在细菌微环境的酸性条件下可释放出Zn

正常的大肠杆菌与金黄色葡萄球菌表面光滑且细胞壁完整，大肠杆菌一般呈现两端钝圆的短杆菌，金黄色葡萄球菌为圆球状。与对照组相比，由于QCS固有的抗菌性，QPP水凝胶组处理1h后细菌表面起皱且部分细胞壁破损。ZnO组处理细菌后，细菌破损明显说明了ZnO-NCs固有的抗菌能力较强。ZC组中CeO

对实施例1制备得到的ZnO-NCs、ZC-NCs、ZC-QPP水凝胶和对比例1制备得到的QPP水凝胶进行抗菌促修效果测试。

测试方法：为了评估ZC-QPP水凝胶对体内伤口的促修复性能，使用SD大鼠(雄性，180-200g)创建伤口模型，伤口形状接近圆形，直径为1cm。首先将金黄色葡萄球菌悬液(3×10

伤口收缩率(％)＝(A

测试结果：如图6所示，采用金黄色葡萄球菌皮肤感染创面模型，与对照组组相比，ZC-QPP水凝胶组创面收缩速度快，一方面是由于ZC-QPP水凝胶中QCS中的带正电基团与细菌细胞膜表面的负电荷相互作用发挥抗菌效果；另一方面是由于凝胶敷料保持了创面湿润环境，促进了创面愈合。ZnO组与ZC组的抗菌效果较好，促进了伤口愈合。ZC-QPP水凝胶组明显加速了伤口闭合，并且创面基本痊愈。通过image J拟合进行创面愈合分析，ZC-QPP水凝胶组7天后创面收缩率为87.5％，而对照组收缩率仅为52.0％。第14天，对照组创面收缩率为87.5％，ZnO与ZC吸附组创面收缩率分别为94.8％和95.1％，而ZC-QPP水凝胶治疗创面基本愈合。以上结果说明了ZC-NCs与QPP水凝胶的联合使用能有效促进细菌感染的创面愈合，且联合效果优于单独各组分。

五、pH响应测试

对实施例1制备得到的ZnO-NCs、ZC-NCs、ZC-QPP水凝胶和对比例1制备得到的QPP水凝胶进行pH响应测试。

测试方法：将负载30mg ZC-NCs的ZC-QPP水凝胶样品浸入10mL不同pH值(5.0和7.4)的磷酸盐(PBS)缓冲液中，在常温下静置，分别孵育1、2、3、4、6、8、12、24h。在每个时间点分别取出8mL上清液，并加入相同体积的PBS缓冲液继续静置，之后通过ICP-OES测定不同时间下上清液中Zn

测试结果：如图7所示，与中性pH条件相比，在pH为5的酸性环境下Zn

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。