一种菠萝酵素粉及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一种菠萝酵素粉及其制备方法。

背景技术

菠萝(Pineapple)又名凤梨，其含有丰富的有机酸、氨基酸、维生素与矿物质等营养成分，并且味道清甜，气味芬芳。菠萝原产于美洲热带地区，在我国菠萝的种植区域主要在广东、广西、福建、台湾等省区，是我国华南地区主要的外销水果。我国菠萝加工品主要有菠萝罐头与菠萝汁，菠萝加工过程中会产生大量的菠萝残渣即菠萝加工副产物，其营养成分与菠萝果肉中的营养成分基本相同。菠萝加工副产物约占菠萝总量的50％，如果不加以利用，不仅会造成浪费，也会成为严重的环境污染源之一。

发明内容

本发明提供一种菠萝酵素粉及其制备方法,本发明的菠萝酵素产品营养全面，富含有机酸、膳食纤维、活性肽、多酚、黄酮等活性物质。

本发明所采用的技术方案是一种菠萝酵素的发酵方法，包括以下步骤，

步骤(1)，样品前处理：新鲜菠萝清洗干净后去皮，对菠萝果肉进行榨汁，对榨汁后的菠萝加工副产物进行收集，加入蒸馏水，与菠萝加工副产物进行搅拌混合成果浆，并添加乳清蛋白搅拌均匀后，调节pH至4.5-5.0，之后置于热水中水浴加热灭菌。

步骤(2)，在上述步骤得到的菠萝加工副产物-乳清蛋白混合物中同时接入实验室筛选的菠萝内生菌乳酸乳球菌和仙人掌有孢汉逊酵母，在36-38℃温度下避光静止培养24-26h。

步骤(3)，将上述步骤得到的发酵物进行冷冻干燥得到菠萝发酵副产物-乳清蛋白粉末，并于-18--20℃储藏。

优选的，所述的步骤(1)中，菠萝加工副产物取300-500g，蒸馏水按40-50％的质量比例加入。

优选的，所述的步骤(1)中，乳清蛋白的添加量为2.0-2.6％。

优选的，所述的步骤(1)中，热水温度为65-72℃，加热灭菌15-20min。

优选的，所述的步骤(2)中，乳酸乳球菌和仙人掌有孢汉逊酵母的添加量分别为1.5-1.8％和0.25-0.3％(w/w)，两株菌的活菌数为10

优选的，所述的步骤(3)中，冷冻干燥的条件为-40--55℃，真空度大于15Pa。

优选的，所述的菠萝内生菌乳酸乳球菌保藏编号为CGMCC 25352，所述的仙人掌有孢汉逊酵母保藏编号为CGMCC 25353。

一种采用菠萝酵素的发酵方法制备的菠萝酵素粉，菠萝酵素粉含有有机酸、多酚、黄酮、膳食纤维、多肽和游离氨基酸，并具有诱人的芳香气味。

本发明的有益效果是：本发明获得的菠萝酵素粉是一种营养全面，富含有机酸、膳食纤维、活性肽、多酚、黄酮等活性物质的菠萝酵素产品，其获得是将菠萝加工副产物和乳清蛋白在乳酸菌和酵母菌的协同发酵下，经真空冷冻干燥得到，该菠萝酵素粉是对人体健康有益的活性物质，菠萝酵素富含乙酸乙酯、乙酸异戊酯等表现为热带水果的风味化合物。在保留菠萝香气的同时，由于加入乳清蛋白进行共同发酵，产品中还具有2,5-二甲基吡嗪、2-辛酮等富含奶酪香气以及乳制品香气的风味化合物。该菠萝酵素产品风味浓郁，具有很好的诱食效果。

附图说明

附图1为菠萝酵素粉的活性肽RP-HPLC-MS/MS总离子流图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件能够以各种不同的配置来布置和设计。

乳酸菌与酵母菌是目前果蔬发酵最常用的菌种。经乳酸菌发酵果蔬既保留了果蔬本身的营养物质，并改善其风味，赋予了产品更高的营养保健价值。酵母菌细胞中含有蛋白质、矿物质等物质，其细胞壁中还含有大量多糖，具有良好的抗氧化活性与免疫活性。相比于单菌种发酵，乳酸菌与酵母菌的混合发酵具有更好的效果。在混合发酵过程中，酵母菌代谢可产生多种营养物质，这些营养物质对于乳酸菌的生长有促进作用，同时酵母菌也能从乳酸菌的发酵产物中获得有益于生长繁殖的物质与能量。

乳清蛋白是牛乳提取酪蛋白等物质的副产物，研究表明，在发酵过程中产生多种生物活性多肽，具有增强体质，提高机体免疫等多种保健功能。由于菠萝加工副产物中蛋白质含量较低，利用乳清蛋白提升菠萝加工副产物蛋白质效价，开发菠萝加工副产物乳清蛋白发酵产品，为果蔬加工副产物的综合利用开辟新的应用途径。本专利利用乳酸菌和酵母菌两种菌株对菠萝加工副产物与乳清蛋白粉进行混菌发酵，以获得具有较好生物活性的酵素产品。

实施示例1：菠萝酵素粉的制备。

(1)样品的前处理

新鲜菠萝清洗干净后去皮，对菠萝果肉进行榨汁，对榨汁后的菠萝残渣即菠萝加工副产物进行收集，取500g残渣，然后按40％的质量比例加入蒸馏水，与菠萝加工副产物进行搅拌混合成果浆，并添加2.6％的乳清蛋白搅拌均匀后，调节pH至4.5，之后置于65℃热水中水浴加热灭菌15min。

(2)发酵菌种子液的制备

将保存在-80℃的，实验室筛选的菠萝内生乳酸菌与内生酵母菌保藏培养物分别接入MRS (乳酸菌培养基)与YPD(酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)液体培养基中。MRS液体培养基在37℃静置过夜培养对乳酸菌进行活化复壮，YPD液体培养基在30℃静置过夜培养对酵母菌进行活化复壮，活化复壮后分别以1.5％的接种量接种入另一相应的培养基中，培养14h作为种子液。

(3)发酵

在上述步骤得到的菠萝加工副产物-乳清蛋白混合物中同时接入乳酸乳球菌，和仙人掌有孢汉逊酵母种子液。菠萝内生菌乳酸乳球菌保藏编号为CGMCC 25352和仙人掌有孢汉逊酵母保藏编号为CGMCC 25353。菠萝内生菌乳酸乳球菌生物名称是DGXX-0714，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名；乳酸乳球菌Lactococcus lactis，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2022年7月20日，仙人掌有孢汉逊酵母生物名称是DGLG-2201，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名：仙人掌有孢汉逊酵母Hanseniaspora opuntiae，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2022年7月20日，其中，乳酸乳球菌和仙人掌有孢汉逊酵母的添加量分别为1.6％和0.25％(w/w)，两株菌的活菌数分别为10

(4)干燥

利用真空冷冻干燥机对上述步骤得到的发酵产物进行干燥，其中冷冻干燥的条件为 -55℃，真空度15Pa，真空冷冻干燥后获得菠萝加工副产物-乳清蛋白酵素粉末。

实施示例2：菠萝酵素粉的理化指标及活性物质的测定

1、分析方法及过程

(1)pH和可滴定酸(TA)的测定：取5g冻干样品，加入5mL蒸馏水，充分混合1min，然后以10000r/min离心10min，以获得用于测定pH和TA的上清液。用校准的pH计测量pH。TA 通过指示剂滴定法测定，并以乳酸的百分比(w/w)表示。

(2)粗蛋白含量的测定：准确称取冻干样品1.0g放入消化管中，添加两片凯尔特催化片(相当于7g K

(3)总可溶性糖：取5g冻干样品，加入5mL蒸馏水，充分混合1min，然后以10000r/min 离心10分钟，以获得用于测定可溶性总糖的上清液。吸取2mL样品，然后加入6％苯酚1mL以及浓硫酸5mL,摇匀冷却室温放置30min以后使用紫外分光光度计于490nm测定其吸光值。并通过葡萄糖标准曲线计算总糖含量。

(4)膳食纤维：称取冻干样品1g，加入蒸馏水30mL并沸水浴15min，冷却后加入淀粉酶与糖化酶于60℃水浴60min，之后加入蛋白酶于40℃水浴90min，之后在沸水浴15min。然后以10000r/min离心10min，离心后沉淀用热水洗涤3次，冻干后得到不可溶膳食纤维。离心后上清液旋蒸体积至原体积的1/4，之后加入4倍体积95％的乙醇静置过夜，采用真空抽滤得到沉淀，冻干后得到可溶性膳食纤维。

(5)总黄酮：以芦丁为标准品采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法绘制黄酮标准曲线。称取1g 冻干样品用5mL 80％乙醇溶液充分混合1min，超声10min，然后以10000r/min离心10min，以获得用于测定总黄酮的上清液。取上清液2mL加入0.4mL质量分数为5％的亚硝酸钠溶液和 0.4mL质量分数为10％的硝酸铝溶液，摇匀后静置10min，再加入4mL质量分数为10％的氢氧化钠溶液，最后用80％的乙醇溶液定容至10mL，使用紫外分光光度计于510nm处测定其吸光度值。

(6)总酚：准确配置质量浓度为0、100、250、400、500、600、750mg/L的没食子酸系列标准溶液。取1g冻干样品，加入5mL蒸馏水，充分混合1min，超声10min，然后以10000 r/min离心10min，以获得用于测定总酚的上清液。取上清液0.05mL，加入5mL蒸馏水与0.5 mLFolin-Phenol混匀，在室温下静置3-4min，加入1.5mL 20％的Na

(7)SOD酶：使用北京索莱宝公司超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒对样品中的SOD 酶活力进行测定。

(8)有机酸：通过HPLC系统与紫外检测器进行测定，色谱柱选用C18-wap。设置进样20μL；流动相(99％0.01mol/L的磷酸二氢钾，1％甲醇，用磷酸调pH至2.6)以0.6mL/min的流速使用。UV-DAD的检测器为210nm。对样品进行三次平行测定，通过保留时间和紫外光谱与乳酸、草酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、抗坏血酸、酒石酸在水中的标准溶液进行比较，并计算样品中各有机酸的含量，以mg/g(w/w)表示

(9)多肽：使用Sep-Pak固相萃取柱对样品中的多肽进行提取与收集。使用6-10个柱体积的乙腈对萃取柱进行平衡，再使用6-10个柱体积的蒸馏水对萃取柱进行冲洗，之后添加样品再添加500μL的蒸馏水洗脱除盐，最后使用1mL 80％的乙腈对样品进行洗脱与收集。使用反相液质联用RPLC-MS对样品中的多肽进行测定，见图1。

2、结果分析

pH和可滴定酸(TA)值是影响发酵过程中微生物生长和代谢产物积累的关键因素。低pH 和高TA值可抑制发酵环境中腐败细菌的生长。菠萝酵素粉的pH值为4.30，TA值为12.33，这可能是由于乳酸菌在发酵过程中产生了大量的酸造成的。菠萝酵素粉的蛋白含量为20.76％，在很大程度上可以补充水果蔬菜发酵制品蛋白含量低的不足，使菠萝酵素粉的营养价值更全面。菠萝酵素粉的可溶性糖的含量为9.41mg/100g，可以为产品提供甜味，并作为重要的能源物质。水溶性膳食纤维是能够溶解于水中的纤维类型。具有黏性，能在肠道中大量吸收水分，使粪便保持柔软状态。水溶性纤维能有效使肠道中的益茵活性化，促进益菌大量繁殖，创造肠道的健康生态。不溶性膳食纤维主要包括纤维素、半纤维素和木质素等。能吸收水分，软化粪便，增加粪便的体积，以刺激肠蠕动，加速排便，预防肠癌发生。菠萝酵素粉中的可溶性和不溶性膳食纤维的含量分别为9.97和13.42mg/100g，总膳食纤维的含量为23.39mg/100g。研究表明，植物多酚黄酮，除了具有抗氧化、清除自由基的功能外，还具有良好的抗菌消炎、增强免疫力、改善心血管、降血脂、抗癌等功效。菠萝酵素粉中的总黄酮和总酚含量较高，分别为0.76mg/g和0.83mg/g。SOD酶具有清除自由基、增强抵抗力、预防衰老等功效，菠萝酵素粉中的SOD酶的活性较高，为168.02U/g，见表1。

有机酸是发酵产品的主要风味属性，其组成和含量是影响最终产品酸味的重要因素。此外，有机酸因其降低肠道pH值和改善肠道菌群的能力而在全世界广泛使用。表2显示了菠萝酵素粉末七种主要有机酸的含量。其中，乳酸是最主要的有机酸，占比36％，含量为4.28mg/g；其次为琥珀酸和柠檬酸，占比分别为29.55％(3.51mg/g)和16.32％(1.94mg/g)。乳酸通常由乳酸菌发酵产生，而琥珀酸是酵母的重要代谢产物，见表2。

多肽及氨基酸：本产品中添加了乳清蛋白与菠萝加工副产物共同进行发酵。在发酵过程中的蛋白质被内源酶与微生物产生的外源酶降解成小分子物质，比如肽与氨基酸。在菠萝酵素粉中共检测出多肽段144条，表4为菠萝酵素粉中含量排在前20的多肽段。见表3，其中多肽段ASDISLLDAQSAPLR、多肽段SDISLLDAQSAPLR以及多肽段AASDISLLDAQSAPLR为抗菌肽，人体食用后对人体肠道健康具有积极作用。

表1菠萝酵素粉产品的理化指标

表2菠萝酵素粉有机酸的含量

表3菠萝酵素中活性肽含量较高的20个肽段

实施示例3：菠萝发酵粉风味物质的测定

1、分析方法及过程：使用气相离子迁移谱对不同发酵时间的菠萝酵素冻干粉的风味物质进行测定。称取1g样品，置于20mL顶空瓶中，60℃孵育15min后进样。分析条件见附表4 和附表5。

表4挥发性风味物质分析条件

表5挥发性风味物质气相色谱条件

2、结果分析

从表中可以看出，菠萝酵素含有丰富的香气物质，共检测出醇类16种、醛类14种、酮类10种，酯类18种、酸类7种、酚类9种、烯烃类4种及16种其他挥发性物质。从菠萝酵素的特征香气化合物中可以看出，菠萝酵素富含乙酸乙酯、乙酸异戊酯等表现为热带水果的风味化合物。在保留菠萝香气的同时，由于加入乳清蛋白进行共同发酵，产品中还具有2,5-二甲基吡嗪、2-辛酮等富含奶酪香气以及乳制品香气的风味化合物。该菠萝酵素产品风味浓郁，具有很好的诱食效果。

表6菠萝酵素中的特征风味物质

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。