口腔癌辅助诊断标志物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种口腔癌辅助诊断标志物、试剂盒及其应用。

背景技术

口腔癌(OSCC)是全身第六位常见肿瘤，其5年生存率较低，约为50％-60％，每年大约有30万新病例，其中145000将死亡，高死亡率在很大程度上归因于早期OSCC无症状，很难发现并诊断。另外，颌面部区域具有丰富的血液和淋巴结，这有助于癌细胞的侵袭和转移。因此，大多数患者在诊断时患有晚期疾病。口腔癌被认为是一个多阶段的过程，多数口腔癌经历了从癌前病变、癌前状态(比如口腔扁平苔藓、白斑、口腔粘膜下纤维化等)的发展过程。口腔癌的预后的关键在于早发现、早诊断、早治疗，通过手术可获得比较理想的预后。目前，用于口腔癌早期诊断的方法主要是临床检查、病理组织活检技术等，具有主观性强、有创、技术水平要求高等特点，难以用于疾病的早期诊断。

脂质代谢的变化是癌细胞的典型标志之一，与肿瘤发生和发展有关。癌细胞消耗大量能量来维持肿瘤细胞的快速增殖。从而导致血液，唾液和组织中脂质的异常表达水平。发生变化的脂质代谢产物可以被认为是区分恶性和良性病变的潜在生物标志物。脂质组学是一种高通量技术，可以量化和全面识别脂质类别和单个脂质种类，其最终目标是揭示病理条件下脂质代谢的变化，从而发现预后或诊断生物标志物。

因此，如何利用脂质组学辅助诊断口腔癌，实现无创、准确，且能在早期发现口腔癌，是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种口腔癌辅助诊断标志物，其中所述辅助诊断标志包括物磷脂酰胆碱PC(18:0/16:0)、甘油三酯TG(17:0/17:1/18:1)、磷脂酰甘油PG(33:0)、神经酰胺Cer(d36:3)、磷脂酰胆碱PC(42:3p)、磷脂酰胆碱PC(38:6)、磷脂酰胆碱PC(34:3)、磷脂酰胆碱PC(34:0)、磷脂酰胆碱PC(34:2e)、磷脂酰胆碱PC(38:4)、甘油三酯TG(18:1/18:1/18:2)、神经酰胺Cer(d18:1/22:1)、神经酰胺Cer(d18:1/24:0)、鞘磷脂SM(d40:1)、甘油三酯TG(18:1/17:1/18:1)、溶血磷脂酰胆碱LPC(20:3)、磷脂酰胆碱PC(16:0/18:3)、磷脂酰乙醇胺PE(18:0/18:3)、鞘磷脂SM(d34:1)和磷脂酰胆碱PC(18:2/20:4)。

在某些实施方式中，所述的口腔癌辅助诊断标志物中，磷脂酰胆碱PC(18:0/16:0)的曲线下面积为0.994、甘油三酯TG(17:0/18:1/18:1)的曲线下面积为0.975、磷脂酰甘油PG(33:0)的曲线下面积为0.958、神经酰胺Cer(d36:3)的曲线下面积为0.949、磷脂酰胆碱PC(42:3p)的曲线下面积为0.947、磷脂酰胆碱PC(38:6)的曲线下面积为0.94、磷脂酰胆碱PC(34:3)的曲线下面积为0.925、磷脂酰胆碱PC(34:0)的曲线下面积为0.918、磷脂酰胆碱PC(34:2e)的曲线下面积为0.905、磷脂酰胆碱PC(38:4)的曲线下面积为0.891、甘油三酯TG(18:1/18:1/18:2)的曲线下面积为0.897、神经酰胺Cer(d18:1/22:1)的曲线下面积为0.889、神经酰胺Cer(d18:1/24:0)的曲线下面积为0.887、鞘磷脂SM(d40:1)的曲线下面积为0.885、甘油三酯TG(18:1/17:1/18:1)的曲线下面积为0.892、溶血磷脂酰胆碱LPC(20:3)的曲线下面积为0.876、磷脂酰胆碱PC(16:0/18:3)的曲线下面积为0.864、磷脂酰乙醇胺PE(18:0/18:3)的曲线下面积为0.867、鞘磷脂SM(d34:1)的曲线下面积为0.864、磷脂酰胆碱PC(18:2/20:4)的曲线下面积为0.866。

本发明另一方面还提供一种辅助诊断口腔癌的应用，其至少使用下述标志物之一，所述标志物包括磷脂酰胆碱PC(18:0/16:0)、甘油三酯TG(17:0/17:1/18:1)、磷脂酰甘油PG(33:0)、神经酰胺Cer(d36:3)、磷脂酰胆碱PC(42:3p)、磷脂酰胆碱PC(38:6)、磷脂酰胆碱PC(34:3)、磷脂酰胆碱PC(34:0)、磷脂酰胆碱PC(34:2e)、磷脂酰胆碱PC(38:4)、甘油三酯TG(18:1/18:1/18:2)、神经酰胺Cer(d18:1/22:1)、神经酰胺Cer(d18:1/24:0)、鞘磷脂SM(d40:1)、甘油三酯TG(18:1/17:1/18:1)、溶血磷脂酰胆碱LPC(20:3)、磷脂酰胆碱PC(16:0/18:3)、磷脂酰乙醇胺PE(18:0/18:3)、鞘磷脂SM(d34:1)和磷脂酰胆碱PC(18:2/20:4)。

本发明另一方面还提供一种口腔癌辅助诊断试剂盒，其包括下述标志物至少之一，所述标志物包括磷脂酰胆碱PC(18:0/16:0)、甘油三酯TG(17:0/17:1/18:1)、磷脂酰甘油PG(33:0)、神经酰胺Cer(d36:3)、磷脂酰胆碱PC(42:3p)、磷脂酰胆碱PC(38:6)、磷脂酰胆碱PC(34:3)、磷脂酰胆碱PC(34:0)、磷脂酰胆碱PC(34:2e)、磷脂酰胆碱PC(38:4)、甘油三酯TG(18:1/18:1/18:2)、神经酰胺Cer(d18:1/22:1)、神经酰胺Cer(d18:1/24:0)、鞘磷脂SM(d40:1)、甘油三酯TG(18:1/17:1/18:1)、溶血磷脂酰胆碱LPC(20:3)、磷脂酰胆碱PC(16:0/18:3)、磷脂酰乙醇胺PE(18:0/18:3)、鞘磷脂SM(d34:1)和磷脂酰胆碱PC(18:2/20:4)。

有益效果：

本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物，该辅助诊断标志物在进行口腔癌诊断时，实现早期诊断，且能够达到微创、诊断准确性、灵敏度、特异度高的特点。

附图说明

图1是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中磷脂酰胆碱PC(18:0/16:0)的受试者工作特征曲线、曲线下面积、95％置信区间图。

图2是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中磷脂酰胆碱PC(18:0/16:0)在患病受试者和健康受试者中含量的柱形图。

图3是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中甘油三酯TG(17:0/17:1/18:1)的受试者工作特征曲线、曲线下面积、95％置信区间。

图4是本发明所述的口腔癌诊断生物标志物中甘油三酯TG(17:0/17:1/18:1)的患病受试者和健康受试者中含量的柱形图。

图5是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中磷脂酰甘油PG(33:0)的受试者工作特征曲线、曲线下面积、95％置信区间。

图6是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中磷脂酰甘油PG(33:0)的患病受试者和健康受试者中含量的柱形图。

图7是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中神经酰胺Cer(d36:3)的受试者工作特征曲线、曲线下面积、95％置信区间。

图8是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中神经酰胺Cer(d36:3)的患病受试者和健康受试者中含量的柱形图。

图9是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中磷脂酰胆碱PC(42:3p)的受试者工作特征曲线、曲线下面积、95％置信区间。

图10是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中磷脂酰胆碱PC(42:3p)的受患病受试者和健康受试者中含量的柱形图。

图11是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中磷脂酰胆碱PC(38:6)的受试者工作特征曲线、曲线下面积、95％置信区间。

图12是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中磷脂酰胆碱PC(38:6)在患病受试者和健康受试者中含量的柱形图。

图13是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中磷脂酰胆碱PC(34:3)的受试者工作特征曲线、曲线下面积、95％置信区间。

图14是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中磷脂酰胆碱PC(34:3)在患病受试者和健康受试者中含量的柱形图。

图15是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中磷脂酰胆碱PC(34:0)的受试者工作特征曲线、曲线下面积、95％置信区间。

图16是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中磷脂酰胆碱PC(34:0)在患病受试者和健康受试者中含量的柱形图。

图17是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中磷脂酰胆碱PC(34:2e)的受试者工作特征曲线、曲线下面积、95％置信区间。

图18是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中磷脂酰胆碱PC(34:2e)在患病受试者和健康受试者中含量的柱形图。

图19是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中磷脂酰胆碱PC(38:4)的受试者工作特征曲线、曲线下面积、95％置信区间。

图20是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中磷脂酰胆碱PC(38:4)在患病受试者和健康受试者中含量的柱形图。

图21是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中甘油三酯TG(18:1/18:1/18:2)的受试者工作特征曲线、曲线下面积、95％置信区间。

图22是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中甘油三酯TG(18:1/18:1/18:2)在患病受试者和健康受试者中含量的柱形图。

图23是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中神经酰胺Cer(d18:1/22:1)的受试者工作特征曲线、曲线下面积、95％置信区间。

图24是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中神经酰胺Cer(d18:1/22:1)在患病受试者和健康受试者中含量的柱形图。

图25是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中神经酰胺Cer(d18:1/24:0)的受试者工作特征曲线、曲线下面积、95％置信区间。

图26是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中神经酰胺Cer(d18:1/24:0)在患病受试者和健康受试者中含量的柱形图。

图27是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中鞘磷脂SM(d40:1)的受试者工作特征曲线、曲线下面积、95％置信区间。

图28是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中鞘磷脂SM(d40:1)在患病受试者和健康受试者中含量的柱形图。

图29是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中甘油三酯TG(18:1/17:1/18:1)的受试者工作特征曲线、曲线下面积、95％置信区间。

图30是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中甘油三酯TG(18:1/17:1/18:1)在患病受试者和健康受试者中含量的柱形图。

图31是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中溶血磷脂酰胆碱LPC(20:3)的受试者工作特征曲线、曲线下面积、95％置信区间。

图32是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中溶血磷脂酰胆碱LPC(20:3)在患病受试者和健康受试者中含量的柱形图。

图33是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中磷脂酰胆碱PC(16:0/18:3)的受试者工作特征曲线、曲线下面积、95％置信区间。

图34是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中磷脂酰胆碱PC(16:0/18:3)在患病受试者和健康受试者中含量的柱形图。

图35是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中磷脂酰乙醇胺PE(18:0/18:3)的受试者工作特征曲线、曲线下面积、95％置信区间。

图36是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中磷脂酰乙醇胺PE(18:0/18:3)在患病受试者和健康受试者中含量的柱形图。

图37是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中鞘磷脂SM(d34:1)的受试者工作特征曲线、曲线下面积、95％置信区间。

图38是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中鞘磷脂SM(d34:1)在患病受试者和健康受试者中含量的柱形图。

图39是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中磷脂酰胆碱PC(18:2/20:4)的受试者工作特征曲线、曲线下面积、95％置信区间。

图40是本发明所述的口腔癌辅助诊断标志物中磷脂酰胆碱PC(18:2/20:4)在患病受试者和健康受试者中含量的柱形图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。关于本文中所使用的“和/或”，包括所述事物的任一或全部组合。除非另有说明，否则％指质量体积百分比。

如图1至40所示，本发明提供一种口腔癌辅助诊断标志物，所述辅助诊断标志物磷脂酰胆碱PC(18:0/16:0)、甘油三酯TG(17:0/17:1/18:1)、磷脂酰甘油PG(33:0)、神经酰胺Cer(d36:3)、磷脂酰胆碱PC(42:3p)、磷脂酰胆碱PC(38:6)、磷脂酰胆碱PC(34:3)、磷脂酰胆碱PC(34:0)、磷脂酰胆碱PC(34:2e)、磷脂酰胆碱PC(38:4)、甘油三酯TG(18:1/18:1/18:2)、神经酰胺Cer(d18:1/22:1)、神经酰胺Cer(d18:1/24:0)、鞘磷脂SM(d40:1)、甘油三酯TG(18:1/17:1/18:1)、溶血磷脂酰胆碱LPC(20:3)、磷脂酰胆碱PC(16:0/18:3)、磷脂酰乙醇胺PE(18:0/18:3)、鞘磷脂SM(d34:1)、磷脂酰胆碱PC(18:2/20:4)。

这类标志物可以单独或两种或两种以上组合来进行口腔癌的诊断。本发明提供的口腔癌标志物共20种，具有准确性、灵敏度、特异度高的特点。其中，有8个生物标志物在口腔癌样本中升高，12个生物标志物在口腔癌样本中降低。所有的20中生物标志物的曲线下面积(AUC)均大于0.85，提示其具有良好的敏感度和特异度。其中PC(18:0/16:0)、甘油三酯TG(17:0/17:1/18:1)、磷脂酰甘油PG(33:0)的AUC大于0.95，可以直接用作口腔癌的早期诊断。

其具体步骤为：

步骤一、获取训练病例集，所述训练病例集中的受试者包括患病受试者和健康受试者；包括患病受试者78例，健康受试者80例。

步骤二、采集所述受试者的血清样本，对所述血清样本进行超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱串联高分辨质谱分析，得到所述患病受试者和所述健康受试者的多个差异脂质代谢物；

78例OSCC患者与80例健康人的血液样本在早上6:00至7:00之间于空腹状态下收集于惰性分离胶促凝管中。样本在4℃下以3000rpm离心10分钟，收取上清液(血清)储存至在-80℃冰箱中，待用。

样本前处理：脂质的提取采用甲基叔丁基醚(methyltert-butylether,MTBE)-甲醇-水体系:将血清样品从-80℃冰箱中取出，放置室温解冻后，取80uL血清样品于4mLEP管中，加入600uL甲醇，涡旋1min，以沉淀血清样本中的蛋白质；后再加入2mLMTBE，涡旋10min，将血清样本中的脂质成分萃取至有机溶剂中；再加入500uL水涡旋5min，4℃条件下以3000×g离心10min，使有机相和水相分层，其中含有脂质的有机相位于上层。分别取上清液800uL于两个2mL离心管，于氮气下吹干，一份用于正离子检测，一份用于负离子检测。吹干后的样品重新用70uL异丙醇/乙腈(9:1体积比)的混合溶剂进行复溶，涡旋10min，使浓缩后的脂质成分充分溶解于有机溶剂中，4℃条件下以13000×g离心10min，每个样本取5uL用于质控样本的制备，其余样本转移至进样小瓶中待质谱检测。

质量控制样本的制备：从每个待测样本中抽取5uL集中于1个2mL离心管中，涡旋震荡1min，样本混匀后，在4℃条件下以13000×g离心10min，取上清液于进样小瓶中待后续质谱分析。检测时首先检测6个QC样品，监测每次进样前后的压力变化和总离子流图主峰保留时间的变化。待确认仪器稳定后，开始分析样本。每检测10个样本后插入一针QC样本。在每个QC样本检测完毕后插入一针纯水溶液以避免污染其他样本。

UHPLC/Q-OrbitrapHRMS分析：从每个样本中吸取5uL，注入40℃柱温的色谱柱。色谱柱为ACQUITY

利用加热电喷雾离子源(Heatedelectrosprayionization，HESI)将高分辨质谱串联到UHPLC系统。辅助气体温度300℃，流量10μL/min；离子传输管温度为320℃。在正、负离子模式下扫描范围为80.00～1200.00m/z，喷雾电压和鞘气流速分别为3.50kV、40μL/min和2.80kV、38μL/min。二级质谱分辨率为17500,质荷比窗口宽度设置为2。梯度碰撞能量分别为20、40和60eV。样本按随机数表法置于进样盘，按顺序逐个进样。

正负离子模式下共检测到2157个离子峰。首先在不对样本加以分组的情况下进行无监督的主成分分析，可以观察到所有样本之间的总体分布趋势，并可以识别出可能的离散点。PCA分析结果显示，质量控制样本聚集在一起，说明质谱机器稳定，数据可靠；OSCC样本和HC样本之间分离趋势明显，说明在癌症样本和健康样本之间存在明显的脂质代谢差异。为了进一步构建和区分组间的差异脂质代谢物，随后进行了有监督的OPLS-DA分析。如图所示，OSCC组和健康组之间明显分离，说明OSCC组发生了脂质代谢紊乱。

步骤三、利用变量权重重要性排序和受试者工作特征曲线，从多个所述差异脂质代谢物确定磷脂酰胆碱PC(18:0/16:0)、甘油三酯TG(17:0/17:1/18:1)、磷脂酰甘油PG(33:0)、神经酰胺Cer(d36:3)、磷脂酰胆碱PC(42:3p)、磷脂酰胆碱PC(38:6)、磷脂酰胆碱PC(34:3)、磷脂酰胆碱PC(34:0)、磷脂酰胆碱PC(34:2e)、磷脂酰胆碱PC(38:4)、甘油三酯TG(18:1/18:1/18:2)、神经酰胺Cer(d18:1/22:1)、神经酰胺Cer(d18:1/24:0)、鞘磷脂SM(d40:1)、甘油三酯TG(18:1/17:1/18:1)、溶血磷脂酰胆碱LPC(20:3)、磷脂酰胆碱PC(16:0/18:3)、磷脂酰乙醇胺PE(18:0/18:3)、鞘磷脂SM(d34:1)和磷脂酰胆碱PC(18:2/20:4)作为口腔癌的辅助诊断生物标志物。

使用LipidSearchv4.0软件(ThermoFisherScientific，UnitedStates)处理从所有样品的LC-MS分析获得的原始数据，然后将每个样品的数据归一化为峰面积，并将所有关于变量的数据(包括保留时间RT和荷质比m/z)、样本编号和归一化峰强度导入SIMCA14.1软件(Umetrics，Sweden)。通过OPLS-DA分析得到各个代谢物的变量权重重要性投影值(Variable importanceinprojection，VIP)，对VIP＞1的脂质代谢物进行独立样本t检验，根据P值、差异倍数(foldchange，FC)筛选出差异有统计学意义的差异脂质代谢物。采用SPSS21.0和Excel软件进行数据分析，采用受试者工作特征曲线(ReceiverOperatorCharacteristicCurve,ROC)来验证差异脂质代谢物的预测效果，AUC的大小判断生物标志物的诊断效力。

由于组学数据具有“高维、海量”的特点，选择单维和多维的方法相结合，避免只用一类统计方法带来的假阳性错误和模型过拟合。通过P值(P＜0.05)、FC值(FC＞2或FC＜0.5)值对差异脂质进行初步筛选，并绘制火山图。结果显示，在正、负离子模式下，OSCC组相较于HC组，上调的脂质共有41个，下调的有46个。进一步通过VIP＞1进一步筛选上述差异脂质。最终在正、负离子模式下，共得到70个差异脂质。其中磷脂酰胆碱PC、甘油三酯TG、神经酰胺Cer、鞘磷脂SM、溶血磷脂酰胆碱LPC、磷脂酰乙醇胺PE、甘油二酯DG、磷脂酰甘油PG的构成比分别为：43％、26％、9％、10％、7％、3％、1％、1％。磷脂酰胆碱PC和甘油三酯TG的总构成比高达69％，表明PC和TG的代谢紊乱可能和OSCC的发病机制相关。采用受试者工作特征曲线(ROC)的曲线下面积(AUC)评估各脂质代谢物对于口腔癌的诊断能力。结果显示以下20种代谢物的AUC大于0.85，诊断效能良好，分别为磷脂酰胆碱PC(18:0/16:0)AUC为0.994、甘油三酯TG(17:0/18:1/18:1)AUC为0.975、磷脂酰甘油PG(33:0)AUC为0.958、神经酰胺Cer(d36:3)AUC为0.949、磷脂酰胆碱PC(42:3p)AUC为0.947、磷脂酰胆碱PC(38:6)AUC为0.94、磷脂酰胆碱PC(34:3)AUC为0.925、磷脂酰胆碱PC(34:0)AUC为0.918、磷脂酰胆碱PC(34:2e)AUC为0.905、磷脂酰胆碱PC(38:4)AUC为0.891、甘油三酯TG(18:1/18:1/18:2)AUC为0.897、神经酰胺Cer(d18:1/22:1)AUC为0.889、神经酰胺Cer(d18:1/24:0)AUC为0.887、鞘磷脂SM(d40:1)AUC为0.885、甘油三酯TG(18:1/17:1/18:1)AUC为0.892、溶血磷脂酰胆碱LPC(20:3)AUC为0.876、磷脂酰胆碱PC(16:0/18:3)AUC为0.864、磷脂酰乙醇胺PE(18:0/18:3)AUC为0.867、鞘磷脂SM(d34:1)AUC为0.864、磷脂酰胆碱PC(18:2/20:4)AUC为0.866。

本发明另一方面还提供一种标志物在辅助诊断口腔癌上的应用，其包括上述标志物在辅助诊断口腔癌上的应用。

本发明另一方面还提供一种口腔癌辅助诊断试剂盒，其至少包括上述诊断标志物之一。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。